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文檔簡介
1、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)系細胞內(nèi)蛋白質(zhì)、脂類和糖類的重要合成場所,是細胞內(nèi)鈣離子的儲存場所,與物質(zhì)運輸、交換、解毒有密切相關(guān)的關(guān)系。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激主要是細胞的一種重要自我防御機制,強烈持續(xù)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激最終誘導(dǎo)細胞不可逆的傷害甚至凋亡。而肝臟細胞內(nèi)富含有許多的內(nèi)質(zhì)網(wǎng),目前研究表明許多肝臟疾病都涉及到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。
目的:近年來內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激被廣大學(xué)者所關(guān)注,發(fā)現(xiàn)其余肝臟疾病有著密切的關(guān)系。本研究的主要目的是探查GRP78對誘導(dǎo)正常人體肝細胞HL7702發(fā)生
2、ERS有何密切的關(guān)系。
方法:含藥血清的制備:SPF級SD大鼠20只,給予25g/(kg·d),灌胃給藥,2次/d,連續(xù)給藥7天,最后1d禁食24h。末次給足全天藥量2h后,麻醉,腹主動脈取血。血液需37℃水浴60min,3000r/min離心15min,然后取上清。56℃水浴30min滅活補體,過濾除菌,-57℃條件下真空干燥48h形成干燥粉末,保存?zhèn)溆?。將RPMI-1640培養(yǎng)液中加入含藥血清,體積分數(shù)為20%(即20mL
3、含藥血清加培養(yǎng)液至100mL),正常血清組(含正常大鼠血清為20%)。細胞株:采用人正常肝細胞株HL-7702。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激模型的建立:細胞正常培養(yǎng)72h后,加入0.10ug/mL衣霉素培養(yǎng)基培養(yǎng)48h。分組與給藥:將細胞分成3組,分別為正常對照組,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激模型組,肝寧方治療組。將重懸于RPMI-1640含藥完全培養(yǎng)基的細胞,每組5個復(fù)孔,每孔加1mL細胞懸液,加入含藥血清培養(yǎng)液1mL,濃度為10ug/mL,培養(yǎng)72h后分離細胞。細胞培
4、養(yǎng)爬片,以抗GRP78為一抗進行標(biāo)記,4℃過夜孵育,用FITC標(biāo)記的二抗進行追蹤標(biāo)記,避光孵育2h,漂洗,甘油封片,在激光共聚焦顯微鏡下觀察GRP78在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及胞漿中的分布情況。RT-PCR檢測GRP78mRNA。Western blot檢測GRP78蛋白表達。
結(jié)果:激光共聚焦顯微鏡下觀察到的GRP78密度,隨著依霉素的增高而增高。Western blot結(jié)果顯示正常組、模型組、治療組內(nèi)GRP78的表達情況:正常肝細胞中的G
5、RP78的蛋白條帶較淡,而模型組細胞中GRP78蛋白條帶較亮,治療組細胞中的GRP78蛋白條帶也較淡。與正常組相比,模型組內(nèi)的GRP78表達量明顯提高(P<0.05)而與治療組內(nèi)的GRP78表達相比,模型組比治療組的表達含量明顯提高(P<0.05),而正常組與治療組表達含量沒有太大區(qū)別(P>0.05)。并且隨著濃度的增加條帶的顏色也加深。RT-PCR檢測結(jié)果:與正常肝細胞細胞相比,0.3ug/ml、0.5ug/ml模型組中的GRP78的
6、表達水平顯著上升,與正常組相比有顯著差別(P<0.05),治療后GRP78的表達水平顯著下降,與正常組表達無明顯區(qū)別(P>0.05)。1ug/ml模型組中的GRP78的表達水平顯著上升,與正常組相比有顯著差別(P<0.05),治療后GRP78的表達水平顯著下降,與模型組有顯著差別(P<0.05),但與正常組表達有顯著區(qū)別(P<0.05)。
結(jié)論:(1)衣霉素誘導(dǎo)正常人體肝細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)模型成功。(2)隨著衣霉素濃度的
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