Bim在黑色素瘤細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激狀態(tài)中的異常調(diào)控及作用.pdf

1、背景及目的:很多實體腫瘤包括黑色素瘤對治療的耐受或者在反復治療的情況下引起的獲得性耐受成為臨床治療的重大障礙,這很大程度上是由于腫瘤細胞對化療藥物誘導凋亡不敏感。目前研究表明除了死亡受體和線粒體途徑外,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)也在調(diào)節(jié)化療藥物誘發(fā)的細胞凋亡中起著重要的作用。一些化療藥物能夠引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激,盡管內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激時的未折疊蛋白反應可通過減緩內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激狀態(tài)而保護細胞,但過強或持續(xù)時間過長的應激反應可引起細胞凋亡。近期研究結果表明:黑色素瘤對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激

2、誘導的凋亡并不敏感,這種抗凋亡機制目前尚未完全明確。但已經(jīng)清楚和線粒體途徑密切相關的BH3-only家族蛋白對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激性凋亡起到重要調(diào)節(jié)作用,其中 Bim在很多對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激性凋亡敏感的細胞中發(fā)生上調(diào)并發(fā)揮重要的促凋亡作用,但目前對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激狀態(tài)下的黑色素瘤細胞中 Bim的表達情況了解甚少,本課題旨在探討 Bim在黑色素瘤細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激狀態(tài)中的調(diào)控以及其在黑色素瘤細胞對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激性凋亡耐受中的作用,從而更加完善黑色素瘤對化療誘導凋亡不敏

3、感的分子機制。
　　方法:采用天然核苷抗生素衣霉素(TM)處理黑色素瘤Mel-RM細胞株、MM200細胞株和對照組HEK293細胞株,建立內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激模型。通過流式細胞術(FCM)Annexin/PIⅤ雙染法及Hoechst染色法檢測細胞凋亡;Western blot檢測caspase-3,-9及PARP的活化和Bim,GRP78,CHOP及FOXO1等蛋白水平;實時熒光定量PCR檢測Bim,CHOP及FOXO1的mRNA水平;小干

4、擾RNA(siRNA)技術特異性“沉默”Bim基因,Western blot檢測Bim的“沉默”效率和“沉默”前后caspase-3的活化情況;采用流式細胞術檢測“沉默”Bim前后TM誘導HEK293細胞凋亡率的變化。
　　結果:TM作用黑色素瘤細胞和HEK293細胞后,兩株細胞對藥物誘導的凋亡均呈劑量和時間依賴性,但黑色素瘤細胞較HEK293細胞相比,對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激性凋亡表現(xiàn)為耐受。對照組HEK293細胞中caspase-3,-9

5、明顯活化,但在黑色素瘤細胞中卻不明顯。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激狀態(tài)下的黑色素瘤細胞中Bim的蛋白水平?jīng)]有上調(diào),mRNA水平下調(diào)。檢測黑色素瘤細胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激狀態(tài)下調(diào)控Bim的轉錄因子CHOP的表達水平上調(diào),另一轉錄因子FOXO1的表達水平下調(diào)。在TM誘導的HEK293細胞中特異性“沉默”Bim基因后caspase-3的活化程度下降,細胞凋亡率也明顯下降。
　　結論:Bim在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激狀態(tài)下的黑色素瘤細胞中受到異常調(diào)控,這可能和轉錄因子CHOP