皮質(zhì)醇調(diào)控人羊膜成纖維細(xì)胞己糖-6-磷酸脫氫酶表達(dá)的分子機制.pdf

1、胎兒器官的成熟與分娩的啟動及維持依賴于妊娠晚期糖皮質(zhì)激素(glucocorticoid，GC)的大量增加。但是母體來源的大部分糖皮質(zhì)激素在經(jīng)過胎盤時會被胎盤糖皮質(zhì)激素屏障酶代謝失活，而人胎兒腎上腺皮質(zhì)只能合成少量的糖皮質(zhì)激素，胎膜11β-羥基類固醇脫氫酶1型(11β-hydroxysteroiddehydrogenase type1，11β-HSD1)活化17-羥-11-脫氫皮質(zhì)酮(cortisone，E)產(chǎn)生的皮質(zhì)醇成為人類妊娠重要的

2、糖皮質(zhì)激素來源之一，此來源的糖皮質(zhì)激素可能在胎兒器官成熟和分娩啟動中發(fā)揮重要作用。11β-HSD1是一種位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的氧化還原雙向作用酶，它活化糖皮質(zhì)激素的還原酶活性是由獲得的NADPH的量決定的，而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中生成NADPH最主要的酶是己糖-6-磷酸脫氫酶(hexose-6-phosphate dehydrogenase，H6PD)。研究表明，H6PD基因敲除鼠的11β-HSD1缺乏再生糖皮質(zhì)激素的能力，提示H6PD在11β-HSD1活化

3、糖皮質(zhì)激素過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，但是在人胎膜中是否存在此作用仍不明了。有研究發(fā)現(xiàn)，妊娠晚期人羊膜中存在皮質(zhì)醇誘導(dǎo)11β-HSD1表達(dá)進而促進自身再生的正反饋環(huán)路，但是皮質(zhì)醇是否需要同時促進H6PD的表達(dá)來維持這個正反饋環(huán)路目前尚不清楚。本課題首先采用免疫組織化學(xué)染色的方法研究了胎膜中H6PD和11β-HSD1的分布，然后以原代培養(yǎng)的人羊膜成纖維細(xì)胞為研究模型，采用Western blotting、實時熒光定量PCR、酶聯(lián)免疫測定（enzy

4、me immunoassay，EIA）、siRNA轉(zhuǎn)染、免疫共沉淀和染色質(zhì)免疫沉(chromatin immunoprecipitation assay，CHIP)等技術(shù)研究了H6PD對11β-HSD1酶活性的影響以及糖皮質(zhì)激素（皮質(zhì)醇）對H6PD表達(dá)的影響和相關(guān)機制。
　　主要研究結(jié)果
　　1.免疫組織化學(xué)染色結(jié)果表明，人胎膜中表達(dá)大量的H6PD，而且在胎膜中H6PD和11β-HSD1的分布基本一致，胎膜的羊膜上皮細(xì)胞、成

5、纖維細(xì)胞、絨毛膜的滋養(yǎng)細(xì)胞等都有兩者的表達(dá)。本課題進一步以原代培養(yǎng)的人羊膜成纖維細(xì)胞為研究模型，用siRNA轉(zhuǎn)染的方法下調(diào)H6PD表達(dá)后，11β-HSD1活化17-羥-11-脫氫皮質(zhì)酮為皮質(zhì)醇的能力顯著降低。此結(jié)果表明H6PD對11β-HSD1酶活性具有至關(guān)重要的作用。
　　2.以原代培養(yǎng)的人羊膜成纖維細(xì)胞為研究模型，通過實時熒光定量PCR和 Western blotting等方法研究發(fā)現(xiàn)，皮質(zhì)醇對H6PD的表達(dá)具有劑量依賴性誘導(dǎo)

6、作用，且此作用能夠被糖皮質(zhì)激素受體(glucocorticoid receptor，GR)拮抗劑RU486和蛋白質(zhì)合成抑制劑CHX阻斷，提示皮質(zhì)醇對H6PD表達(dá)的誘導(dǎo)作用需要GR和其他蛋白合成的參與。
　　3.通過實時熒光定量PCR和Western blotting等方法研究發(fā)現(xiàn)，皮質(zhì)醇呈劑量依賴性誘導(dǎo)人羊膜成纖維細(xì)胞組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(histone acetyltransferase，HAT)p300的表達(dá)，而且此作用同樣可以被

7、GR拮抗劑RU486所阻斷，提示皮質(zhì)醇通過GR誘導(dǎo)p300的表達(dá)。用p300抑制劑C646（抑制p300乙酰轉(zhuǎn)移酶活性）和皮質(zhì)醇共孵育人羊膜成纖維細(xì)胞研究發(fā)現(xiàn)，C646阻斷了皮質(zhì)醇對H6PD表達(dá)的誘導(dǎo)作用，提示p300可能是受皮質(zhì)醇誘導(dǎo)合成并參與調(diào)控H6PD表達(dá)的蛋白之一。
　　4.生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)H6PD啟動子上存在多個可能的糖皮質(zhì)激素反應(yīng)元件（glucocorticoid response element，GRE）;通過免疫

8、共沉淀實驗發(fā)現(xiàn)，皮質(zhì)醇能夠促進人羊膜成纖維細(xì)胞GR與p300結(jié)合形成蛋白復(fù)合體;ChIP實驗結(jié)果顯示，皮質(zhì)醇能夠提高與H6PD基因啟動子結(jié)合的組蛋白H3K9的乙酰化水平，而p300抑制劑C646能夠抑制皮質(zhì)醇的這種促進作用。綜合以上結(jié)果，我們推斷皮質(zhì)醇與GR結(jié)合后，一方面促進p300的表達(dá)，另一方面與p300結(jié)合形成蛋白復(fù)合體結(jié)合到H6PD啟動子上，緊接著p300乙?；疕6PD啟動子上的H3K9，進而誘導(dǎo)H6PD的表達(dá)。
　　結(jié)論