糖皮質(zhì)激素反常誘導(dǎo)人羊膜成纖維細(xì)胞胞漿型磷酯酶A2α表達(dá)的分子機(jī)制.pdf

1、早產(chǎn)和過期產(chǎn)嚴(yán)重危害新生兒健康,目前尚缺乏有效的干預(yù)手段,其主要原因在于人類分娩啟動機(jī)制尚未解析。前列腺素是公認(rèn)的哺乳類動物包括人類分娩啟動的最后通路,花生四烯酸是前列腺素的重要合成前體,而胞漿型磷脂酶A2α(cPL～A2α)是負(fù)責(zé)從磷脂釋放花生四烯酸最為重要的磷脂酶。人類妊娠晚期子宮內(nèi)組織大量表達(dá)cPLA2α,其中以羊膜組織表達(dá)量最高,約占整個子宮內(nèi)組織磷脂酶活性的70％左右。隨孕期進(jìn)展,入羊膜oPLA2α表達(dá)量隨之增加,在分娩啟動之

2、前達(dá)到最高峰值,因此人羊膜cPLA2α水平上升被認(rèn)為是分娩啟動中的重要事件。糖皮質(zhì)激素是公認(rèn)的經(jīng)典抑制炎癥激素,在多數(shù)細(xì)胞中糖皮質(zhì)激素抑制cPLA2α表達(dá),但是在人羊膜成纖維細(xì)胞中,糖皮質(zhì)激素卻反常誘導(dǎo)cPLA2α表達(dá),糖皮質(zhì)激素的這一反常誘導(dǎo)作用被認(rèn)為是人類分娩啟動的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一,但是糖皮質(zhì)激素此反常誘導(dǎo)作用的分子機(jī)制至今仍未解析。
　　本研究采用對糖皮質(zhì)激素具有反常反應(yīng)的原代人羊膜成纖維細(xì)胞和對糖皮質(zhì)激素具有經(jīng)典反應(yīng)的人胎兒肺

3、成纖維細(xì)胞株(HFL-1)為研究模型,采用實(shí)時熒光定量PCR、Westernblotting、啟動子克隆與活性測定、RNA干擾和功能蛋白過表達(dá)、免疫共沉淀、染色質(zhì)免疫沉淀和ELISA等實(shí)驗(yàn)技術(shù),聯(lián)合類固醇激素及其受體阻斷劑給藥、信號通路激動劑及拮抗劑給藥和蛋白酶抑制劑給藥等實(shí)驗(yàn)方法,通過比較糖皮質(zhì)激素對兩種細(xì)胞模型cPLA2α表達(dá)的不同調(diào)控,分析得到了糖皮質(zhì)激素反常誘導(dǎo)人羊膜成纖維細(xì)胞cPLA2α表達(dá)的一些關(guān)鍵因素。冀希望通過此研究為解

4、析人類分娩啟動機(jī)制和臨床干預(yù)早產(chǎn)以及過期妊娠提供新的思路。主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:
　　1.實(shí)時熒光定量PCR和Westernblotting實(shí)驗(yàn)表明,皮質(zhì)醇(0.01-1μM)呈劑量依賴性反常誘導(dǎo)人羊膜成纖維細(xì)胞cPLA2α表達(dá),該誘導(dǎo)作用與皮質(zhì)醇對HFL-1細(xì)胞cPLA2α表達(dá)的經(jīng)典抑制作用形成鮮明對比。
　　2.采用實(shí)時熒光定量PCR和Westernblotting實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),皮質(zhì)醇(1μM)對人羊膜成纖維細(xì)胞cPLA2α表達(dá)

5、的誘導(dǎo)作用被糖皮質(zhì)激素受體(GR)拮抗劑RU486(1μM)、mRNA轉(zhuǎn)錄抑制劑DRB(75μM)N蛋白質(zhì)合成抑制劑CHX(10μM)阻斷,提示皮質(zhì)醇對人羊膜成纖維細(xì)胞cPLA2α表達(dá)的誘導(dǎo)作用需要糖皮質(zhì)激素受體(GR)參與介導(dǎo),該作用發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平,此外,該作用還需要合成其他蛋白參與。
　　3.實(shí)時熒光定量PCR和Westernblotting實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),皮質(zhì)醇(0.01-1μM)劑量依賴性抑制包括白細(xì)胞介素1β、腫瘤壞死因子α和

6、白細(xì)胞介素6三種早產(chǎn)相關(guān)的重要促炎癥細(xì)胞因子mRNA的表達(dá);此外,皮質(zhì)醇(1μM)能夠正常誘導(dǎo)人羊膜成纖維細(xì)胞NFκB抑制因子-IκBα的表達(dá)。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,皮質(zhì)醇對人羊膜成纖維細(xì)胞NFκB炎癥通路和上述促炎性細(xì)胞因子的經(jīng)典抑炎作用沒有發(fā)生異常,皮質(zhì)醇無法通過反常激活上述炎癥通路來參與對人羊膜成纖維細(xì)胞cPLA2α表達(dá)的上調(diào)作用。
　　4.ELISA、常規(guī)PCR和Westernblotting實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),原代人羊膜成纖維細(xì)胞本身

7、能夠合成分泌少量孕激素;而且,該細(xì)胞表達(dá)的孕激素受體以A亞型(PRA)為主,基本不表達(dá)B亞型。免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)、siRNA基因沉默和PRA過表達(dá)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),人羊膜成纖維細(xì)胞內(nèi)源性孕激素能夠激活自身的PRA,PRA進(jìn)一步與GR形成異源二聚體,削弱GR的轉(zhuǎn)錄功能,從而削弱皮質(zhì)醇對人羊膜成纖維細(xì)胞cPLA2α表達(dá)的誘導(dǎo)作用。此外,采用外源性孕激素模擬人類妊娠晚期高濃度孕激素環(huán)境對皮質(zhì)醇功能影響的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),孕激素本身對人羊膜成纖維細(xì)胞cPLA2α基

8、礎(chǔ)表達(dá)無明顯作用,但是當(dāng)孕激素濃度高出皮質(zhì)醇濃度10倍以上時,孕激素顯著性削弱皮質(zhì)醇對cPLA2α的誘導(dǎo)作用。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,人羊膜成纖維細(xì)胞表達(dá)的PRA不利于皮質(zhì)醇功能的發(fā)揮,而且,人類妊娠晚期所特有并區(qū)別于其他多數(shù)哺乳動物的高濃度孕激素環(huán)境也不利于皮質(zhì)醇功能的發(fā)揮,因此,皮質(zhì)醇對人羊膜成纖維細(xì)胞cPLA2α的誘導(dǎo)作用與上述高濃度孕激素環(huán)境無關(guān)。
　　5.將cPLA2α啟動子克隆并構(gòu)建進(jìn)入報告基因質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染細(xì)胞后測定啟動子活性

9、發(fā)現(xiàn),皮質(zhì)醇促進(jìn)人羊膜成纖維細(xì)胞-595bpcPLA2α啟動子活性,表明介導(dǎo)皮質(zhì)醇反常誘導(dǎo)cPLA2α的關(guān)鍵序列位于該595bp序列之內(nèi)。采用PCR克隆含有GRE順式元件突變位點(diǎn)的啟動子進(jìn)行報告基因活性測定實(shí)驗(yàn)和染色質(zhì)免疫沉淀實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),皮質(zhì)醇對人羊膜成纖維細(xì)胞cPLA2α啟動子活性的促進(jìn)作用是通過皮質(zhì)醇促進(jìn)GR與位于cPLA2α啟動子-490bp～-485bp位置的遠(yuǎn)端GRE元件結(jié)合實(shí)現(xiàn)的,令人意外的是,該GRE元件卻在HFL-1細(xì)胞中

10、介導(dǎo)了皮質(zhì)醇對cPLA2α啟動子活性的抑制作用,提示皮質(zhì)醇對人羊膜成纖維細(xì)胞cPLA2α表達(dá)促進(jìn)作用的決定因素不僅需要GR參與,還有其他因素參與。
　　6.利用信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路工具藥(cAMP、Fomkolin和H89等)、WesternBlotting和染色質(zhì)免疫沉淀等技術(shù)研究發(fā)現(xiàn),皮質(zhì)醇能夠激活人羊膜成纖維細(xì)胞cAMP/PKA/CREB-1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,增加CREB-1的第133位Ser的磷酸化水平;磷酸化的CREB-1能夠與GR

11、結(jié)合形成促轉(zhuǎn)錄復(fù)合體,共同定位到cPLA2α啟動子-490bp～-485bp位置遠(yuǎn)端GRE元件,最終完成皮質(zhì)醇對cPLA2α轉(zhuǎn)錄表達(dá)的促進(jìn)作用。此外,采用第133位Ser突變?yōu)锳la的重組表達(dá)載體(dn-CREB-1質(zhì)粒)轉(zhuǎn)染細(xì)胞發(fā)現(xiàn),過表達(dá)dn-CREB-1能夠削弱皮質(zhì)醇對cPLA2α表達(dá)的誘導(dǎo)作用,該結(jié)果與上述結(jié)論一致。有趣的是,皮質(zhì)醇對HFL-1細(xì)胞CREB-1的磷酸化具有抑制作用,該結(jié)果與皮質(zhì)醇對人羊膜成纖維細(xì)胞CREB-1磷酸

12、化的誘導(dǎo)作用形成鮮明對比。上述結(jié)果提示皮質(zhì)醇對人羊膜成纖維細(xì)胞cPLA2α的反常誘導(dǎo)作用的決定因子與能夠激活cAMP/PKA/CREB-1信號通路的因子密切相關(guān)。
　　7.利用信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路工具藥(RU486和NF449)并結(jié)合WesternBlotting技術(shù)研究發(fā)現(xiàn),皮質(zhì)醇誘導(dǎo)人羊膜成纖維細(xì)胞Gαs表達(dá)增加,該誘導(dǎo)作用可以被RU486阻斷,與此形成鮮明對比的是,皮質(zhì)醇并不影響HFL-1細(xì)胞Gαs的表達(dá)水平。將上述結(jié)果結(jié)合CHX的

13、實(shí)驗(yàn)結(jié)果,提示Gαs很可能是介導(dǎo)糖皮質(zhì)激素反常誘導(dǎo)cPLA2α表達(dá)的關(guān)鍵蛋白之一。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),Gαs活性抑制劑NF449既能夠削弱皮質(zhì)醇對人羊膜成纖維細(xì)胞CREB-l的促磷酸化作用,也能夠削弱皮質(zhì)醇對該細(xì)胞cPLA2α表達(dá)的誘導(dǎo)作用,提示皮質(zhì)醇所誘導(dǎo)的Gαs是皮質(zhì)醇反常誘導(dǎo)人羊膜成纖維細(xì)胞cPLA2α表達(dá)的關(guān)鍵因素之一。
　　綜上所述,皮質(zhì)醇對人羊膜成纖維細(xì)胞cPLA2α表達(dá)的反常誘導(dǎo)作用與NFκB炎癥通路的反轉(zhuǎn)無關(guān),與人類妊

14、娠晚期特有的高濃度孕激素環(huán)境無關(guān),而與cAMP/PKA/CREB-1信號通路激活密切相關(guān)。初步解析的分子機(jī)制如下:皮質(zhì)醇通過誘導(dǎo)人羊膜成纖維細(xì)胞Gαs表達(dá),從而激活cAMP/PKA/CREB-1信號通路,使得CREB-1第133位蘇氨酸(Ser)磷酸化增加,磷酸化CREB-1與激活的GR形成促轉(zhuǎn)錄復(fù)合體,該復(fù)合體定位到cPLA2α啟動子遠(yuǎn)端位于-490bp～-485bp之間的GRE元件上,最終促進(jìn)cPLA2α的表達(dá)。在HFL-1細(xì)胞中,