Neuronatin(NNAT)在豬卵母細(xì)胞老化過程中的作用及調(diào)控機(jī)制.pdf

1、卵母細(xì)胞成熟之后如果不能在特定的時間窗口內(nèi)完成受精，會發(fā)生老化。排卵后老化的卵母細(xì)胞會嚴(yán)重影響受精后胚胎的進(jìn)一步發(fā)育。在許多生理活動中DNA甲基化都起到重要的調(diào)節(jié)作用，但卻很少有研究關(guān)注在卵母細(xì)胞老化過程中DNA甲基化的變化。卵母細(xì)胞的老化類型分為體內(nèi)老化或體外老化，以及排卵前老化或排卵后老化。本研究選取成熟后處在MⅡ階段的豬卵母細(xì)胞，研究其在體外老化過程中印記基因DNA甲基化的改變及其相關(guān)基因功能的改變。我們的主要結(jié)果如下:
　

2、　1.在豬卵母細(xì)胞體外老化的過程中，通過實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(quantitative Real-time Polymerase Chain Reaction，qRT-PCR)的方法檢測印記基因(GRB10，IGF2，PEG1，PEG10，H19，NNAT)、母源效應(yīng)基因(BRG1，ZAR1，BMP15，TET3)以及干細(xì)胞多能性基因(POU5F1，SOX2，CDX2)的表達(dá)，我們發(fā)現(xiàn)不同老化時間(24h或48h)和卵丘細(xì)胞對豬卵

3、母細(xì)胞中以上基因的表達(dá)沒有影響。因此后續(xù)的研究選擇無卵丘細(xì)胞體外老化24h。
　　2.通過比較印記基因在豬卵母細(xì)胞老化過程中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在體外老化24h和48h的豬卵母細(xì)胞中PEG1和NNAT的表達(dá)下調(diào)，但24h和48h差異不大。通過分別對新鮮的卵母細(xì)胞和體外老化24h的卵母細(xì)胞進(jìn)行孤雌激活，發(fā)現(xiàn)新鮮卵母細(xì)胞中有45.0％可以發(fā)育為囊胚，而體外老化24h的卵母細(xì)胞僅有14.0％。此外，我們還檢測了新鮮卵母細(xì)胞和體外老化24h孤雌激

4、活的囊胚中印記基因的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在老化豬卵母細(xì)胞中NNAT的表達(dá)顯著下調(diào)。
　　3.我們通過重亞硫酸鹽測序(BSP,bisulfite DNA sequencing)和聯(lián)合重亞硫酸鹽限制分析(COBRA，combined bisulfite restriction analysis)的方法檢測體外老化的豬卵母細(xì)胞和孤雌激活后囊胚中NNAT和H19的DNA甲基化模式。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在卵母細(xì)胞老化的過程中NNAT的甲基化水平升高，而H1

5、9的甲基化水平無顯著差異。BSP和COBRA的結(jié)果表明，豬卵母細(xì)胞老化對孤雌激活的囊胚中NNAT和H19的甲基化模式均沒有影響。
　　4.使用免疫熒光染色的方法檢測豬卵母細(xì)胞老化過程中NNAT蛋白水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)老化過程中NNAT蛋白水平發(fā)生顯著下調(diào)。
　　5.為了確定豬卵母細(xì)胞老化是否影響葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)，使用2-NBDG追蹤卵母細(xì)胞中葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，老化組與新鮮組相比2-NBDG的攝取發(fā)生顯著下調(diào)，即卵母細(xì)胞老化阻斷了

6、卵母細(xì)胞中的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)。
　　6.為了確定NNAT是否影響豬卵母細(xì)胞中的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)能力，我們將NNAT的抗體顯微注射進(jìn)新鮮MⅡ卵母細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中以阻斷NNAT的功能。結(jié)果表明與注射IgG的對照組相比，注射NNAT抗體的卵母細(xì)胞中2-NBDG的熒光強(qiáng)度顯著降低，表明NNAT的損失影響了老化卵母細(xì)胞的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)。
　　以上的結(jié)果表明在老化的豬卵母細(xì)胞中NNAT是通過上調(diào)DNA甲基化水平而下調(diào)其表達(dá)，并且通過降低葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)的能力影