PGC-1α和NRF-1在山羊卵泡閉鎖、卵母細胞老化及克隆胚胎發(fā)育過程中作用的研究.pdf

1、在卵泡生長發(fā)育過程中，大多數(shù)卵泡都發(fā)生了閉鎖退化，只有少數(shù)卵泡能夠發(fā)育成熟和排卵，如果排出的卵母細胞未及時受精則發(fā)生老化，將嚴重影響后續(xù)的發(fā)育潛能。線粒體在動物卵泡發(fā)育、卵子成熟及其后續(xù)胚胎發(fā)育的過程中起著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，線粒體轉錄相關因子PGC-1α（過氧化物酶體增生激活受體γ協(xié)同刺激因子）和NRF-1（核呼吸因子-1）能協(xié)同促進線粒體增殖，對調(diào)控線粒體的功能和抵抗氧化損傷有重要的作用，然而關于其調(diào)控卵泡閉鎖、卵母細胞老化以及體外

2、胚胎發(fā)育的研究還比較少。隨著輔助生殖技術的發(fā)展，對卵母細胞質(zhì)量的要求越來越高，選擇優(yōu)質(zhì)胚胎進行移植也顯得尤為重要。因此，了解卵泡發(fā)育與閉鎖的規(guī)律、探索卵母細胞老化的分子機制和找出能預測胚胎發(fā)育潛能的標記物，對豐富內(nèi)分泌生殖生理學和完善輔助生殖技術具有重要意義。本試驗主要分為以下四個部分:
　　試驗一、PGC-1α和NRF-1在山羊卵泡發(fā)育和閉鎖過程中表達變化的研究
　　剝離性成熟山羊卵巢中的卵泡，然后按照不同直徑(≤2mm、

3、2～5mm和≥5mm)和狀態(tài)（健康和閉鎖）分組，通過qRT-PCR和Western blot等方法，初步探索PGC-1α和NRF-1在山羊卵泡發(fā)育和閉鎖過程中的表達變化。結果表明:PGC-1α、NRF-1、BCL-2和BAX四個蛋白主要在各發(fā)育階段卵泡的顆粒細胞內(nèi)表達。隨著卵泡的發(fā)育（卵泡體積的增大），PGC-1α和NRF-1的表達量(mRNA和蛋白)顯著升高(P＜0.05)。與健康卵泡相比，閉鎖卵泡內(nèi)雌激素的含量和雌激素/孕酮的比值顯

4、著降低(P＜0.05)，并且PGC-1α和NRF-1的表達量也有降低的趨勢，而BAX的表達量與BAX/BCL-2的比值顯著升高(P＜0.05)。綜上所述，在山羊卵泡發(fā)育過程中，PGC-1α和NRF-1基因表達模式的改變，可能會導致卵泡閉鎖。
　　試驗二、PGC-1α和NRF-1調(diào)控體外培養(yǎng)山羊顆粒細胞凋亡的研究
　　分離健康卵泡的顆粒細胞進行體外培養(yǎng)，通過干擾或過表達PGC-1α與NRF-1基因，研究PGC-1α與NRF-1

5、對體外培養(yǎng)顆粒細胞凋亡的調(diào)控。結果表明:PGC-1α與NRF-1蛋白主要在顆粒細胞的胞質(zhì)內(nèi)表達，干擾PGC-1α或NRF-1能顯著減少顆粒細胞內(nèi)mtDNA的拷貝數(shù)(P＜0.05);減少SOD2、GPx和CAT的表達量(P＜0.05);增加Caspase3、Caspase9和BAX基因的表達量以及BAX/BCL-2的比值(P＜0.05);增強細胞內(nèi)Caspase3和Caspase9的活性(P＜0.05)，改變細胞內(nèi)BAX和BCL-2的蛋白

6、表達量(P＜0.05)，并顯著增加顆粒細胞的凋亡率(P＜0.05)。過表達PGC-1α與NRF-1能在一定程度上抑制顆粒細胞凋亡的發(fā)生。此外，流式細胞周期檢測發(fā)現(xiàn)，干擾或過表達PGC-1α與NRF-1對顆粒細胞周期無顯著性影響。綜上所述，在體外培養(yǎng)的顆粒細胞中，PGC-1α與NRF-1的表達異常，可能會導致顆粒細胞的凋亡。
　　試驗三、PGC-1α和NRF-1在山羊卵母細胞老化過程中作用的研究
　　首先通過孤雌激活胚胎的發(fā)育

7、率和TUNEL凋亡檢測判斷體外培養(yǎng)卵母細胞老化的時間點(24、30、36、48和60 h)，然后在卵母細胞（成熟和未成熟）和卵丘細胞中通過qRT-PCR檢測目的基因(PGC-1α、NRF-1、HAT1、SNRPN、HAS3、SMAD2、BAX、BCL-2、HAS2、STAR和SOD1)的表達變化，并試圖通過卵丘細胞基因的表達變化預測卵母細胞的老化進程。結果表明:隨著卵母細胞體外培養(yǎng)時間的延長(24～60 h)，孤雌激活的囊胚率顯著降低(

8、P＜0.05)，凋亡的卵丘細胞顯著增多（P＜0.05）。在成熟的卵母細胞中，PGC-1α、NRF-1和SMAD2基因的表達量隨著培養(yǎng)時間的延長(24～36 h)而顯著降低(P＜0.05);HAT1和HAS3基因的表達量隨著培養(yǎng)時間的延長(24～60 h)而緩慢升高。目的基因在未成熟卵母細胞中的表達模式與在成熟卵母細胞中的表達模式相似。另外，在卵丘細胞中，隨著培養(yǎng)時間的延長(24～36 h)，PGC-1α、BCL-2、HAS2和SOD1基

9、因的表達量顯著降低(P＜0.05)，而BAX基因的表達量顯著升高(P＜0.05)。綜上所述，在山羊卵母細胞體外培養(yǎng)過程中，卵母細胞的老化開始于體外培養(yǎng)的第30 h，伴隨著卵母細胞的老化，卵母細胞和卵丘細胞的基因表達模式均發(fā)生了明顯的改變。線粒體相關基因可能是預測卵母細胞質(zhì)量的潛在分子標記物。
　　試驗四、PGC-1α和NRF-1評價山羊轉基因克隆胚胎體外發(fā)育潛能的初步研究
　　基于以上研究，本試驗擬進一步從代謝物質(zhì)變化角度分

10、析線粒體相關基因與胚胎發(fā)育潛能是否存在相關性。因此，本試驗以山羊轉基因克隆胚胎為研究對象，根據(jù)不同的形態(tài)標準（高質(zhì)量:Avs低質(zhì)量:B）對胚胎進行分組培養(yǎng)，體外發(fā)育至囊胚時，收集各組的囊胚和對應的胚胎代謝液進行分析。結果發(fā)現(xiàn)，A組的囊胚率顯著高于B組(P＜0.05)。氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術分析發(fā)現(xiàn)，不同組間代謝液中有多種顯著性的代謝差異物，這些物質(zhì)的變化多與氨基酸和能量代謝相關，而線粒體又是能量代謝中心。因此，本試驗進一步分析了線粒體相

11、關基因在克隆胚胎中的表達。qRT-PCR結果發(fā)現(xiàn)，在低質(zhì)量組（B組）的囊胚中，線粒體相關基因PGC-1α和NRF-1的表達量顯著降低(P＜0.05)，BAX/BCL-2的比值顯著升高(P＜0.05)。這一結果提示:在低質(zhì)量的胚胎中，PGC-1α和NRF-1的表達異常，可能會導致線粒體的損傷進而影響山羊轉基因克隆胚胎的質(zhì)量。綜上所述，結合胚胎的形態(tài)評估，找出與山羊轉基因克隆胚胎質(zhì)量密切相關的分子和代謝標記物，為尋找預測胚胎發(fā)育潛能的研究提