抗冷凍蛋白AFPⅢ在玻璃化冷凍過程中對小鼠卵母細(xì)胞和胚胎保護(hù)作用的研究.pdf

1、目的：
　　第一部分，抗冷凍蛋白AFPⅢ對小鼠2-細(xì)胞胚胎的冷凍保護(hù)作用
　　將抗冷凍蛋白AFPⅢ應(yīng)用于小鼠2-細(xì)胞胚胎的玻璃化冷凍保存，觀察其對細(xì)胞微絲骨架結(jié)構(gòu)是否有保護(hù)作用和胚胎冷凍復(fù)蘇后發(fā)育潛能。
　　第二部分，抗冷凍蛋白AFPⅢ對小鼠卵母細(xì)胞的冷凍保護(hù)作用
　　觀察玻璃化冷凍對小鼠MⅡ期卵母細(xì)胞的損傷及抗冷凍蛋白AFPⅢ是否在冷凍過程中對其細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能起保護(hù)作用。
　　方法：
　　第一部分，

2、抗冷凍蛋白AFPⅢ對小鼠2-細(xì)胞胚胎的冷凍保護(hù)作用
　　1.2-細(xì)胞胚胎獲取:健康性成熟昆明系雌性小鼠，8-12周齡，質(zhì)量30-35g，腹腔注射PMSG10IU/只，48h后腹腔注射HCG10IU/只，與雄性性成熟昆明小鼠按照1∶1合籠過夜，次日清晨觀察雌鼠陰道栓，將有陰道栓的雌鼠和雄鼠分開飼養(yǎng)，在注射HCG后的46-48h后頸椎脫臼法處死雌性小鼠，在體視鏡下分離出輸卵管，用無菌針頭刺破輸卵管壺腹膨大處，獲取2-細(xì)胞小鼠胚胎。

3、r>　　2.分組:將獲得1200枚胚胎隨機(jī)分為新鮮對照組、玻璃化冷凍組及添加AFPⅢ(500ng/mL)玻璃化冷凍組，每組400枚，200枚繼續(xù)培養(yǎng)觀察發(fā)育潛能，200枚行微絲免疫熒光染色。
　　3.玻璃化冷凍復(fù)蘇:2-細(xì)胞胚胎采用玻璃化冷凍，冷凍復(fù)蘇存活的胚胎繼續(xù)培養(yǎng)觀察其囊胚形成情況，并統(tǒng)計(jì)冷凍組復(fù)蘇率和三組的囊胚形成率。
　　4.胚胎微絲觀察:固定、透化、封閉的胚胎加入預(yù)熱到37℃的0.1ug/mLFITC-結(jié)合的鬼筆

4、環(huán)肽，免疫熒光染色60分鐘，統(tǒng)計(jì)三組微絲完整比率。
　　5.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用X2檢驗(yàn)，檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)均為0.05，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　第二部，分抗冷凍蛋白AFPⅢ對小鼠卵母細(xì)胞的冷凍保護(hù)作用
　　1.卵母細(xì)胞獲取:健康性成熟昆明雌性小鼠，8-12周齡，質(zhì)量30-35g，腹腔注射PMSG10IU/只，48h后腹腔注射HCG10IU

5、/只，18-20h后頸椎脫臼法處死小鼠，在體視鏡下分離卵巢、部分子宮和輸卵管，刺破輸卵管壺腹部獲取成熟卵母細(xì)胞（MⅡ期）。
　　2.分組:將獲取卵母細(xì)胞1200枚隨機(jī)分為Ⅳ組，分別為新鮮對照組，添加冷凍保護(hù)新鮮組，玻璃化冷凍組，添加AFPⅢ(500ng/mL)玻璃化冷凍組，每組300枚，其中100枚進(jìn)行體外授精觀察其囊胚形成率，100枚行微管微絲免疫熒光染色，100枚行實(shí)時(shí)定量PCR分析相關(guān)基因的表達(dá)。
　　3.玻璃化冷凍復(fù)

6、蘇:卵母細(xì)胞行玻璃化冷凍，玻璃化冷凍組復(fù)蘇存活的卵母細(xì)胞行體外受精。
　　4.精子獲取:雄性小鼠附睪尾部獲取精子懸液，進(jìn)行梯度離心處理，在倒置顯微鏡下將已獲能的精子至于G-IVF培養(yǎng)液中并調(diào)整密度為3-6×106/mL。
　　5.體外受精:向含有精子的培養(yǎng)液中添加卵母細(xì)胞，37℃、6％CO2培養(yǎng)箱中共同孵育，受精后5-9h觀察雙原核出現(xiàn)情況，于受精后第2、3、4、5天分別觀察2細(xì)胞、4細(xì)胞、8細(xì)胞及囊胚的發(fā)育情況，并計(jì)算受精

7、率，囊胚形成率。
　　6.微管蛋白觀察:固定、透化、封閉后的卵母細(xì)胞加入預(yù)熱到37℃，1∶250稀釋的抗小鼠a-tubulin單克隆抗體，4℃封閉過夜，37℃、1∶100稀釋的FITC結(jié)合的山羊抗兔IgG，37℃培養(yǎng)箱中避光染色120min。
　　7.微絲觀察:將已固定、透化、封閉的卵母細(xì)胞、2細(xì)胞、4細(xì)胞、8細(xì)胞和囊胚加入預(yù)熱到37℃、0.1ug/mLFITC-結(jié)合的鬼筆環(huán)肽，37℃、6％CO2培養(yǎng)箱中避光染色60min。

8、
　　8.染色體觀察:經(jīng)微管、微絲染色后清洗的卵母細(xì)胞在室溫下置于DAPI中避光反染3min。
　　9.熒光實(shí)時(shí)定量PCR測定基因的表達(dá):通過卵母細(xì)胞的裂解、分離、沉淀、RNA的洗脫、再溶解;紫外分光光度儀測量RNA的純度和濃度，逆轉(zhuǎn)錄，實(shí)時(shí)定量PCR(10μL體系)方法來測定基因Mad2、Eg5、Cenp-e和Cirbp的相對表達(dá)量。
　　10.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)

9、，計(jì)數(shù)資料統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用X2檢驗(yàn)，四組基因表達(dá)量用GraphPadPrism5軟件U檢驗(yàn)進(jìn)行分析，mRNA提取實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)三次。檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)均為0.05，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　第一部分，抗冷凍蛋白AFPⅢ對小鼠2-細(xì)胞胚胎的冷凍保護(hù)作用
　　1.添加AFPⅢ玻璃化冷凍組胚胎復(fù)蘇率高于玻璃化冷凍組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　2.新鮮對照組和添加AFPⅢ玻璃化冷凍組囊胚形成率、微

10、絲完整胚胎比率均高于玻璃化冷凍組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）;新鮮對照組和添加AFPⅢ玻璃化冷凍組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　第二部分抗冷凍蛋白AFPⅢ對小鼠卵母細(xì)胞的冷凍保護(hù)作用
　　1.AFPⅢ玻璃化冷凍組卵母細(xì)胞紡錘體、微絲和染色體完整的比率高于玻璃化冷凍組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），新鮮對照組和添加冷凍保護(hù)劑新鮮組之間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，但是顯著高于后兩組且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.

11、05)。
　　2.新鮮對照組、添加冷凍保護(hù)劑新鮮組及AFPⅢ玻璃化冷凍組Mad2、CENP-EmRNA相對表達(dá)量高于玻璃化冷凍組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);然而玻璃化冷凍組CIRP、Eg5的mRNA相對表達(dá)量高于其他三組，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，其他三組表達(dá)量沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　3.新鮮對照組、添加冷凍保護(hù)劑新鮮組的受精率高于其他兩組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而AFPⅢ玻璃化冷凍組

12、復(fù)蘇率、受精率均高于玻璃化冷凍組，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，前兩組之間沒有顯著性差異(P＞0.05)。四組的囊胚形成率沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　結(jié)論：
　　第一部分，抗冷凍蛋白AFPⅢ對小鼠2-細(xì)胞胚胎的冷凍保護(hù)作用
　　1.添加AFPⅢ玻璃化冷凍組胚胎復(fù)蘇率高于玻璃化冷凍組。
　　2.新鮮對照組和添加AFPⅢ玻璃化冷凍組囊胚形成率、微絲完整胚胎比率均高于玻璃化冷凍組。
　　3.新鮮對照組

13、和添加AFPⅢ玻璃化冷凍組之間無顯著性差異。
　　第二部分抗冷凍蛋白AFPⅢ對小鼠卵母細(xì)胞的冷凍保護(hù)作用
　　1.AFPⅢ玻璃化冷凍組卵母細(xì)胞紡錘體、微絲和染色體完整的比率高于玻璃化冷凍組，新鮮對照組和添加冷凍保護(hù)劑新鮮組之間沒有顯著性差異，但是顯著高于后兩組。
　　2.新鮮對照組、添加冷凍保護(hù)劑新鮮組及AFPⅢ玻璃化冷凍組Mad2、CENP-EmRNA相對表達(dá)量高于玻璃化冷凍組;然而玻璃化冷凍組CIRP、Eg5的mR