β2腎上腺素受體激動劑克倫特羅對睪丸間質(zhì)細(xì)胞與脂肪細(xì)胞共培養(yǎng)體系中睪丸間質(zhì)細(xì)胞INSL3及3β-HSD的表達(dá)效應(yīng).pdf

1、目的：
　　1.應(yīng)用3T3-L1脂肪細(xì)胞體外培養(yǎng)體系，探討克倫特羅（clenbuterol，CLB），萊克多巴胺（ractopamine，RAC）和齊帕特羅（zilpaterol，ZIL）對脂肪細(xì)胞過氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome proliferators activated receptorγ，PPARγ）及脂聯(lián)素（adiponectin，ADP）表達(dá)的影響及差異，闡明CLB，RAC，ZIL引起脂肪細(xì)胞內(nèi)分泌紊

2、亂的分子機(jī)制，以及三者對脂肪內(nèi)分泌紊亂相關(guān)性生殖疾病潛在的影響。
　　2.建立脂肪細(xì)胞與睪丸間質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)模型，探討成熟脂肪細(xì)胞對睪丸間質(zhì)細(xì)胞胰島素樣因子（Insulin-like factor。INSL3）及3β-羥基類固醇脫氫酶（3β-hydroxysteroid dehydrogenase，3β-HSD）的表達(dá)效應(yīng)，有助于闡明肥胖誘導(dǎo)男性不育癥的分子機(jī)制。
　　3.建立脂肪細(xì)胞與睪丸間質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)模型，探討CLB對共培

3、養(yǎng)體系中睪丸間質(zhì)細(xì)胞INSL3及3β-HSD表達(dá)的影響，闡明CLB在脂肪內(nèi)分泌紊亂相關(guān)性男性生殖疾病中可能介導(dǎo)的環(huán)節(jié)。
　　材料與方法：
　　1.材料
　　1.13T3-L1脂肪細(xì)胞
　　3T3-L1前脂肪細(xì)胞株購自于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫，定向誘導(dǎo)為3T3-L1成熟脂肪細(xì)胞后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
　　1.2 TM3睪丸間質(zhì)細(xì)胞
　　TM3睪丸間質(zhì)細(xì)胞由暨南大學(xué)禹艷紅老師惠贈，培養(yǎng)傳代后可進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
　　2

4、.實(shí)驗(yàn)分組及給藥
　　2.13T3-L1脂肪細(xì)胞分組及給藥
　　本項(xiàng)實(shí)驗(yàn)添加不同劑量的藥物培養(yǎng)12h，24h后分別收集細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞活性與PPARγ及ADP表達(dá)水平的檢測。本項(xiàng)實(shí)驗(yàn)分組見表1。(此處圖表省略）
　　2.2共培養(yǎng)體系分組及給藥
　　將睪丸間質(zhì)細(xì)胞分別與成熟脂肪細(xì)胞，添加5μM CLB處理的成熟脂肪細(xì)胞共培養(yǎng)48小時(shí)，分別標(biāo)記為脂肪細(xì)胞與睪丸間質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)組，CLB處理脂肪細(xì)胞與睪丸間質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)組；

5、另添加5μM CLB處理睪丸間質(zhì)細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)，標(biāo)記為CLB處理睪丸間質(zhì)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組；將單獨(dú)培養(yǎng)的睪丸間質(zhì)細(xì)胞設(shè)為對照組。
　　3.實(shí)驗(yàn)方法
　　3.13T3-L1前脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)及鑒定
　　3T3-L1前脂肪細(xì)胞用含10％胎牛血清（FBS）的DMEM高糖培養(yǎng)液在37℃，5%CO2條件培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁，生長至接觸抑制后2天進(jìn)行成脂誘導(dǎo)分化，更換含有0.5mM IBMX、10μg/ml胰島素和1μM地塞米松的誘導(dǎo)劑及10%FB

6、S的DMEM高糖培養(yǎng)液。2天后，更換只含10μg/ml胰島素及10%FBS的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，每2天換液1次。8-10天后，90%的細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)脂滴，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。油紅O染色鑒定成熟脂肪細(xì)胞。
　　3.2 TM3睪丸間質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)
　　TM3睪丸間質(zhì)細(xì)胞用含10%馬血清的DMEM/F12培養(yǎng)液，在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每2天換液1次，直至細(xì)胞融合達(dá)80%以上，可進(jìn)行傳代。
　　3.3共培養(yǎng)體系的建立
　　采

7、用Transwell系統(tǒng)進(jìn)行3T3-L1脂肪細(xì)胞和TM3睪丸間質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)。3T3-L1脂肪細(xì)胞種入6孔培養(yǎng)板，經(jīng)誘導(dǎo)后，在Transwell小室種入TM3睪丸間質(zhì)細(xì)胞。在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時(shí)。
　　3.43T3-L1脂肪細(xì)胞活性檢測
　　MTT分別檢測不同劑量CLB，RAC，ZIL對3T3-L1脂肪細(xì)胞活性的影響。
　　3.5脂肪因子PPARγ及ADP，睪丸間質(zhì)細(xì)胞INSL3及3β-HSD的表達(dá)

8、r>　　RT-PCR和Western blot檢測脂肪因子PPARγ、ADP，睪丸間質(zhì)細(xì)胞INSL3、3β-HSD表達(dá)水平的變化。
　　4.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
　　數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析。采用單因素方差分析（ANOVA），有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義則用Tukey法作組間均數(shù)的兩兩比較。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.3T3-L1脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)及鑒定
　　3

9、T3-L1前脂肪細(xì)胞生長接觸抑制后，經(jīng)誘導(dǎo)8-10天，3T3-L1前脂肪細(xì)胞可分化為成熟脂肪細(xì)胞。并經(jīng)油紅O染色鑒定，大約90%的3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化為成熟脂肪細(xì)胞。
　　2. CLB，ZIL，RAC對3T3-L1脂肪細(xì)胞活性的影響及差異
　　與對照組相比，CLB，RAC，ZIL分別處理12h和24h后各劑量組細(xì)胞活性均呈下降趨勢，劑量越大，活性影響越大，差異顯著（P<0.05）。
　　培養(yǎng)12h，細(xì)胞活性：B組

10、0.05）；C組0.05），C組0.05）。培養(yǎng)24h。B組0.05）；C組　　3. CLB，ZIL，RAC對3T3

11、-L1脂肪細(xì)胞PPARγ及ADP表達(dá)的影響及差異
　　CLB，RAC，ZIL對PPARγ、ADP的表達(dá)影響基本呈一致性。CLB，RAC。ZIL均下調(diào)PPARγ、ADP mRNA和蛋白的表達(dá)水平，且表達(dá)水平從高到低的順序?yàn)椋旱蛣┝拷M，中劑量組，高劑量組（P<0.05）。
　　培養(yǎng)12h，PPARγ的表達(dá)水平：B組0.05）；C組

12、2組，D組　　培養(yǎng)12h，ADP的表達(dá)水平：B組0.05）；D組0.05），B1組0.05）；C組

13、D2組，D1組0.05）。
　　4.脂肪細(xì)胞共培養(yǎng)及CLB對睪丸間質(zhì)細(xì)胞INSL3及3β-HSD表達(dá)的影響
　　與睪丸間質(zhì)細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)對照組對比，CLB處理睪丸間質(zhì)細(xì)胞組INSL3表達(dá)下降，但無顯著差異（P>0.05），脂肪細(xì)胞與睪丸間質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)組INSL3表達(dá)下降（P<0.05）；CLB處理脂肪細(xì)胞與睪丸間質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)組INSL3下降程度

14、更大（P<0.05）。與睪丸間質(zhì)細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)對照組對比，CLB處理睪丸間質(zhì)細(xì)胞組3β-HSD表達(dá)升高，但無顯著差異（P>0.05）；脂肪細(xì)胞與睪丸間質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)組3β-HSD表達(dá)下降（P<0.05）；CLB處理脂肪細(xì)胞與睪丸間質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)組3β-HSD下降程度更大（P<0.05）。
　　結(jié)論：
　　1. CLB，ZIL，RAC按影響程度從大至小依次降低脂肪細(xì)胞活性，下調(diào)PPARγ、ADP mRNA和蛋白的表達(dá)水平，并呈劑量依

15、賴性，提示 CLB，ZIL。RAC影響PPARγ和ADP的合成，可導(dǎo)致脂肪細(xì)胞內(nèi)分泌紊亂，從而可能引起脂肪內(nèi)分泌紊亂相關(guān)性生殖活動。
　　2.β2AR激動劑對脂肪細(xì)胞內(nèi)分泌功能的效應(yīng)與激動劑種類相關(guān)，CLB，ZIL。RAC這3種激動劑對脂肪細(xì)胞產(chǎn)生效應(yīng)不同，其中CLB影響最大，ZIL次之。RAC影響較小。
　　3.與脂肪細(xì)胞共培養(yǎng)下，睪丸間質(zhì)細(xì)胞INSL3與3β-HSD的表達(dá)下降可能是肥胖引發(fā)男性生殖疾病的重要機(jī)制；CLB與