人逼尿肌細胞腎上腺素能β-,3-受體基因亞型細胞的培養(yǎng)及干預性實驗.pdf

1、本文分為兩部分論述了人逼尿肌細胞腎上腺素能β<,3>受體基因亞型細胞的培養(yǎng)及干預性實驗。 第一部分：為進一步探討β-AR亞型在逼尿肌中的功能奠定基礎(chǔ)，擬采用反義基因(antisense)技術(shù)，構(gòu)建β-AR亞型的RNA干涉質(zhì)粒體，封閉三種β-AR中的任意兩個，得到表達單一亞型的細胞克隆，再進一步進行研究，以確定β-AR激活對逼尿肌細胞的松弛和增殖的影響，并為尋找新的最終解決膀胱逼尿肌活動亢進的治療方法提供理論依據(jù)。 研究材

2、料與方法： 一、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染逼尿肌細胞。 (一)實驗材料：293H、細胞購自．Invitrogen公司；DMEM培養(yǎng)基；100mg/L氨芐青霉素、50mg/L鏈霉素；10％胎牛血清(四季青公司)；PBS(磷酸鹽緩沖溶液)；胰酶/EDTA消化液：Lipofecter脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑；β<,1>-PGS質(zhì)粒和β<,3>-PGs質(zhì)粒。 (二)實驗器材：20ul/200ul/1ml微量移液器和Tip頭；酒精燈；廢液缸；渦旋振

3、蕩器；恒溫水浴箱；臺式離心機；35mm培養(yǎng)皿；轉(zhuǎn)染管；15ml離心管；觀察用倒置顯微鏡。 (三)實驗步驟： 1、細胞傳代。 2、細胞轉(zhuǎn)染： 二、正常傳代逼尿肌細胞與轉(zhuǎn)染后細胞的β-AR受體表達鑒定。 (一)RT-PCR。 1、主要試劑：RNA提取試劑TRIzol Reagent公司產(chǎn)品；總RNA分離試劑為GIBCOBRL公司產(chǎn)品；逆轉(zhuǎn)錄試劑SuPERSCREPTTM Preamplific

4、ation System Kit為GIBCOBRL公司產(chǎn)品；Dnasei GIBCOBRL公司產(chǎn)品；PCR試劑TaKaRa公司產(chǎn)品；RNA LAPCR<'TM>Kit(AMV)為TaKaRa公司產(chǎn)品；JMl09大腸桿菌感受態(tài)菌株購于Takara公司。 2、主要儀器設(shè)備。超純水裝置-美國MILLIPORE MILLI-Q；實驗室制冰機-德國ZIGERA 2BE．70-35；振蕩水浴箱-美國GFL THERMOLAB；超低溫冰箱-日

5、本SANYO MDF-U4086S；鼓風干燥箱-中國余姚TDW；旋渦振蕩器-美國 VORTEX-2 GENE； (二)免疫蛋白印跡雜交(Western blot)。 1、主要試劑。 (1)鼠單克隆抗體p27(Santa Cruze公司)。 (2)ECL試劑盒(Santa Cruze公司)。 (3)辣根過氧化酶標記羊抗鼠二抗。 2、主要儀器。超聲波細胞破碎儀-德國Dr．hielscher G

6、mbH UP 50H紫外透射儀-英國UVItec STX-20M電動勻漿器-德國Heidolph DIAX 900真空冷凍干燥機一德國CHRIST ALPHAI-4半干轉(zhuǎn)印儀-美國Bio-Rad公司Seimidry transfer system水平搖床-美國GFL自動封膜儀Shandon Citadil 2000組織脫水機-美國。 實驗結(jié)果 1、RT-PCR鑒定脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染逼尿肌細胞結(jié)果電泳結(jié)果顯示：與空載體轉(zhuǎn)染的逼尿肌

7、及未被轉(zhuǎn)染的正常傳代的逼尿肌細胞相比，β<,1>-AR和β<,2>-AR干涉分子轉(zhuǎn)染逼尿肌細胞中β<,1>-AR，β<,2>-ARmRNA表達顯著減少，β-actin mRNA表達無顯著差異，說明RNAi對β<,1>-AR、β<,3>-AR mRNA表達抑制是特異性的。光密度掃描結(jié)果顯示pGC-β<,1>-ARi轉(zhuǎn)染細胞與空細胞相比β<,1>-ARmRNA表達抑制率可達77％，pGC-β<,3>-ARi轉(zhuǎn)染細胞與空細胞相比β<,2>-A

8、RmRNA表達抑制率可達79％。 2、蛋白電泳鑒定脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染逼尿肌細胞的結(jié)果通過Westem印跡檢測了β-AR蛋白表達的變化，蛋白電泳結(jié)果顯示：與陰性對照空載體轉(zhuǎn)染的逼尿肌及未被轉(zhuǎn)染的正常傳代的逼尿肌細胞相比，β1-AR和β<,2>-AR干涉分子轉(zhuǎn)染的細胞中蛋白表達水平顯著下降，而兩者的β-actin蛋白表達無顯著差異，說明RNAi抑制β-AR蛋白的表達是特異性的。光密度掃描結(jié)果顯pGC-β1-ARi和pGC-β<,2>-ARi

9、的抑制率分別為83％和87％。 研究結(jié)論： 成功地完成了腎上腺素能β-AR單一基因亞型的細胞系的建立，這就為以后的實驗奠定了實驗基礎(chǔ)。 第二部分：觀察了非選擇性β-AR激動劑異丙腎上腺素分別對于三種β-腎上腺素能受體單一基因亞型的逼尿肌細胞的作用結(jié)果，我們以期通過測定細胞內(nèi)cAMP水平的變化來評價β-腎上腺素能受體亞型的功能。 研究材料與方法： 一、實驗材料。 1、DMEM培養(yǎng)基；100m

10、g/L氨芐青霉素、50mg/L鏈霉素；10％胎牛血清(四季青公司)；PBS(磷酸鹽緩沖溶液)；胰酶/EDTA消化液； 2、cAMP放射免疫試劑盒購于北京環(huán)亞泰克生物醫(yī)學技術(shù)有限公司。 3、異丙腎上腺素(10<'-6>mol/L)購于Sigma公司試劑配制：使用時，各種試劑都用三羥甲基氨基甲烷(Tris)緩沖液(TE)配制。 二、主要儀器設(shè)備。 1、離心機．美國GFL THERMOLAB。 2、水浴

11、箱．美國MILLIPORE MILLI-Q。 3、SN-682放射免疫γ計數(shù)器．日本SANYO MDF-U4086S。 4、超低溫冰箱-德國Dr．hIelscher GmbH UP 50H。 三、實驗方法。 1、將原代培養(yǎng)的膀胱逼尿肌細胞，空載體轉(zhuǎn)染的逼尿肌細胞和經(jīng)過鑒定的β腎上腺素能受體單一基因亞型細胞克隆分別加入100μl異丙腎上腺素(4個濃度組-10<'7>、10<'-8>、10<'-9>、10<'

12、-10>mol/L)。 2、用超聲細胞破碎儀破碎細胞(30s×5次)，12000r/min 4℃離心10 min，然后分別吸取上清液留用。 3、cAMP的測定按cAMP放射免疫試劑盒說明書進行 實驗結(jié)果： 細胞內(nèi)cAMP水平在異丙腎上腺素(10<'-10>～10<'-7>mol/L)作用下呈劑量依賴性升高，當異丙腎上腺素(ISO)濃度超過10<'-8>mol/L時，可見明顯升高cAMP的效應，最大作用見于

13、10<'-7>mol/L。β<,1>、β<,2>、β<,3>三種基因亞型的逼尿肌細胞產(chǎn)生了不同的cAMP水平，而且在ISO各個濃度(10<'-1>、10<'-8>、10<'-9>、10<'-10>mol/L)以β<,3>-受體亞型的逼尿肌細胞產(chǎn)生的cAMP水平最高。表2，IsoR寸不同類型逼尿肌細胞刺激的cAMP產(chǎn)生量(單位pmol/ml)討論膀胱過度活動癥是一種以尿急癥狀為特征的征候群，常伴有尿頻和夜尿癥狀，可伴或不伴有急迫性尿失禁。

14、 本研究分別采用反義基因技術(shù)，得到含有一種β-AR表達的逼尿肌細胞，然后用非選擇性β-AR激動劑異丙腎上腺素處理細胞以消除激動劑親和性和效能差異造成的影響，采用放射免疫檢測法測定，確定β-AR激活對逼尿肌細胞的松弛和增殖的影響，及其信號途徑和調(diào)節(jié)機制。 從本實驗中可以看到細胞內(nèi)cAMP水平呈異丙腎上腺素劑量依賴性升高，而且通過反義技術(shù)得到的β<,1>β<,2>β<,3>三種基因亞型細胞的cAMP水平同樣呈Iso劑量依賴性

15、增長，而且可以看到以β<,3>一受體亞型的逼尿肌細胞產(chǎn)生的cAMP水平最高，從而可以說明β<,3>受體亞型在介導逼尿肌的松弛過程中起著更為主要的作用，而其它兩種受體則起著從屬的作用，當然cAMP增加水平僅是判斷各受體功能的指標之一，此外還包括Ac活性和細胞膜電流和電位等等其他一些方面，需要我們進一步試驗去證明，為闡明β受體在膀胱逼尿肌活動亢進中可能發(fā)揮的作用，并為尋找新的最終解決膀胱逼尿肌活動亢進的治療方法提供理論依據(jù)。 研究結(jié)