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文檔簡介
1、目的:
已經(jīng)有研究表明,3β-羥基類類固醇脫氫酶(3β-hydroxysteroid dehydrogenase,3β-HSD)是睪酮合成過程中重要的合成酶。而且近年來,對白藜蘆醇的研究十分多,特別是它能抗炎、抗癌和抗氧化等療效備受關(guān)注,但它在生殖方面的研究不多。本研究的目的是觀察白藜蘆醇是否會特異性抑制3β-HSD來減少雄激素的合成。
方法:
1、將30只SD大鼠分為3組,分別是對照組,50mg/kg和1
2、00mg/kg白藜蘆醇組,灌胃2天,通過放射性免疫方法(RIA)檢測大鼠睪酮的含量。
2、取18只35天齡的SD大鼠,脫臼處死大鼠取其睪丸,分離純化未成熟的睪丸間質(zhì)細(xì)胞(immature Leydig cell,ILC),通過3β-HSD染色鑒定出其純度達(dá)95%。在24孔板中鋪上分離純化后的ILC,每個孔含0.05×106個細(xì)胞。加入0.5mlDMEM∶F12培養(yǎng)基(無酚紅)作為培養(yǎng)基,再加入100μM白藜蘆醇,1ng/ml黃
3、體生成激素(luteinizing hormone,LH)和2μM下列化合物:8溴-3',5'環(huán)腺苷(8-Bromoadenosine3',5'-cyclic monophosphate,8BR),22R-羥膽固醇(22R-hydroxycholesterol,22R),孕烯醇酮(pregnenolone,PREG),孕酮(progesterone,P4)和雄烯二酮(androstenedione,D4)處理3小時(其中乙醇作為對照組)
4、。取培養(yǎng)基測5α-雄甾烷-3α,17β-二醇(5α-androstane-3α,17β-diol,DIOL)用放射性免疫方法(radioimmunoassay,RIA)測量。
3、取35天SD大鼠睪丸,制備獲取微粒體并測定其濃度。利用所制備的微粒體來檢測3β-HSD,細(xì)胞色素17α-乙烯羥化酶/20裂解酶(17α-hydroxylase/20-1yase,CYP17A1)和17β-HSD3(17β-hydroxysteroid
5、 dehydrogenase)的活性。
1)測定3β-HSD活性:
在活性測試管中加入0.2μM PREG和4000dpm[3H]PREG,0.2mM NAD+,10μg大鼠睪丸微粒體或者50μg人睪丸微粒體,反應(yīng)90分鐘,確定了白藜蘆醇的最大抑制濃度。根據(jù)白藜蘆醇的最大抑制濃度確定反應(yīng)體系:0.01-20μMPREG和4000dpm[3H]PREG,0.2mM NAD+,10μg大鼠睪丸微粒體或者50μg人睪丸微粒
6、體,白藜蘆醇(5μM或10μM)。上述體系在34C孵育1小時,之后加入2ml冰乙醚終止反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后,氮氣揮干有機(jī)相,萃取類固醇。用薄層色譜(氯仿∶甲醇=97∶3,V/V)將類固醇分開,并用Bioscan檢測類固醇的放射性,并計算出PREG轉(zhuǎn)化為P4的轉(zhuǎn)化率。
2)測定CYP17A1活性
在活性測試管中加入1μM P4和4000dpm[3H]P4,0.2mM NAD+,10μg大鼠睪丸微粒體或者50μg人睪丸微粒體
7、反應(yīng)90分鐘,確定了白藜蘆醇的最大抑制濃度。根據(jù)白藜蘆醇的最大抑制濃度確定反應(yīng)體系:0.01-20μM P4和4000dpm[3H]P4,0.2mM NADPH,10μg大鼠睪丸微粒體或者50μg人睪丸微粒體,白藜蘆醇(5μM或10μM)。上述體系在34℃孵育1小時,之后加入2ml冰乙醚終止反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后,氮氣揮干有機(jī)相,萃取類固醇。用薄層色譜(氯仿∶甲醇=7∶1,V/V)將類固醇分開,并用Bioscan檢測類固醇的放射性,并計算出P
8、4轉(zhuǎn)化為17-羥基孕酮的轉(zhuǎn)化率。
3)17β-HSD3活性
在活性測試管中加入200μM D4和4000dpm[3H]D4,0.2mM NAD+,9μg大鼠睪丸微粒體或者9μg人睪丸微粒體反應(yīng)60分鐘,確定了白藜蘆醇的最大抑制濃度。根據(jù)白藜蘆醇的最大抑制濃度確定反應(yīng)體系:0.01-20μM D4和4000dpm[3H]D4,0.2mM NADPH,9μg大鼠睪丸微粒體或者9μg人睪丸微粒體,白藜蘆醇(5μM或10μM
9、)。上述體系在34℃孵育1小時,之后加入2ml冰乙醚終止反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后,氮氣揮干有機(jī)相,萃取類固醇。用薄層色譜(氯仿∶甲醇=97∶3,V/V)將類固醇分開,并用Bioscan檢測類固醇的放射性,并計算出D4轉(zhuǎn)化為睪酮(testosterone,T)的轉(zhuǎn)化率。
結(jié)果:
1、白藜蘆醇會競爭性抑制3β-HSD的活性,從而抑制了ILC合成雄激素。
2、白藜蘆醇抑制大鼠3β-HSD的活性是具有濃度依賴性的,半抑制濃
10、度(halfmaximal inhibitory concentration,IC50)是3.87±0.06μM,同時白藜蘆醇也能抑制人3β-HSD的活性,IC50是8.48±0.04μM。
3、當(dāng)PREG作為底物時,我們發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇是競爭性抑制大鼠3β-HSD的活性。白藜蘆醇可能也是競爭性抑制人3β-HSD的活性。
4、通過白藜蘆醇急性實驗發(fā)現(xiàn),對照組、50mg/kg和100mg/kg白藜蘆醇組中大鼠血清睪酮的含量
11、分別是1.304±0.097ng/ml、0.697±0.050ng/ml和0.644±0.058ng/ml,這說明了白藜蘆醇會降低大鼠血清中睪酮的含量。
5、我們發(fā)現(xiàn)100μM白藜蘆醇對大鼠和人的CYP17A1的作用十分微弱(IC50>100μM),并且100μM白藜蘆醇對17β-HSD3不產(chǎn)生抑制作用。
結(jié)論:
白藜蘆醇會特異性抑制人和大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞3β-HSD的活性,從而影響了睪丸間質(zhì)細(xì)胞合成睪酮的功
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