白藜蘆醇抑制糖尿病腎病腎間質纖維化的作用和機制研究.pdf

1、本研究以大鼠腎間質成纖維細胞(NRK-49F)以及人腎小管上皮細胞(HK-2)為體外研究對象，并利用了C57BL/Ksj/db/db-(db/db)小鼠為2型糖尿病動物模型，分以下三部分對白藜蘆醇抑制糖尿病腎病腎間質纖維化的作用及機制進行研究:(1)首先明確高糖誘導腎間質成纖維細胞增殖、活化和腎小管上皮細胞EMT的作用機制;(2)其次探討白藜蘆醇是否能夠通過調控AMPK/NADPH信號通路抑制高糖誘導的腎間質成纖維細胞增殖、活化及腎小管

2、上皮細胞EMT;(3)最后通過觀察2型糖尿病動物模型db/db小鼠予以白藜蘆醇干預后腎間質纖維化情況以及對腎臟內AMPK/NADPH信號通路的影響，進一步探討了白藜蘆醇在抑制糖尿病腎病腎間質纖維化的可能機制。
　　主要研究結果和研究內容如下:
　　一、高糖可以通過活化NOX4促進ROS生成，誘導腎成纖維細胞增殖與活化;
　　Western blot檢測顯示，與正常對照組相比，高糖(30 mmol/L)處理48 h后大鼠

3、腎間質成纖維細胞NRK-49F肌成纖維細胞標志物α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)和ECM的重要組分纖維粘連蛋白(Fibronectin)表達均明顯升高，這說明在高糖誘導下，靜止的成纖維細胞向肌成纖維細胞的表型轉化，分泌和合成ECM增多。同時，CCK-8檢測提示，高糖可以誘導NRK細胞增殖。
　　鑒于ROS在糖尿病腎病發(fā)病機制中的重要作用，我們用DCFH-DA法檢測高糖作用NRK細胞48 h后細胞內ROS水平的變化。結果發(fā)現，高糖可

4、以誘導NRK細胞內ROS水平顯著升高，而NADPH氧化酶抑制劑二苯基碘(DPI)(10μmol/L)可以明顯抑制高糖引起的細胞內ROS產生增多，這說明高糖誘導NRK細胞內ROS產生的主要來源為NADPH氧化酶。接下來我們通過Western blot檢測NADPH氧化酶在NRK細胞中表達的主要活性亞基，并發(fā)現高糖可以引起NRK細胞NOX4的表達增加，而NOX1、NOX2的表達并無明顯變化。為了明確NOX4在高糖誘導NRK細胞增殖、活化中的

5、作用，我們用DPI預孵育細胞1h后，CCK-8檢測細胞增殖情況以及Western blot檢測細胞活化情況。結果發(fā)現，DPI可以顯著抑制高糖誘導的NRK細胞增殖與活化，這說明高糖是通過促進NOX4依賴的ROS產生來誘導細胞增殖與活化。
　　二、白藜蘆醇可以抑制高糖誘導NOX4來源的ROS生成及腎成纖維細胞的增殖與活化;
　　為了明確白藜蘆醇對高糖誘導NRK細胞增殖與活化的作用，我們用白藜蘆醇(5-20μmol/L)預孵育細胞

6、后，CCK-8檢測細胞増殖情況。結果發(fā)現，高糖可以顯著誘導NRK細胞增殖，而白藜蘆醇劑量依賴性地抑制高糖引起的細胞增殖。同時Westernblot檢測發(fā)現，白藜蘆醇(20μmol/L)抑制了高糖誘導的NRK細胞活化。另外，與DPI類似，白藜蘆醇可以明顯抑制高糖引起的細胞內NOX4表達增加和ROS產生增多，提示了白藜蘆醇可以通過抑制高糖誘導的NOX4依賴的ROS升高，從而抑制NRK細胞的增殖和活化。
　　三、白藜蘆醇通過激活AMPK

7、信號通路抑制NADPH氧化酶活化和ROS生成，從而進一步抑制高糖誘導的腎成纖維細胞增殖與活化;
　　糖尿病中，NADPH氧化酶是AMPK信號分子潛在的下游靶點。我們用Western blot檢測p-AMPK的表達時發(fā)現，高糖可以抑制NRK細胞AMPK信號活性，而白藜蘆醇則上調高糖引起的AMPK信號活性降低。不僅如此，AMPK信號通路抑制劑CompoundC(10μmol/L)可以阻遏白藜蘆醇對高糖誘導的NRK細胞增殖、活化以及NO

8、X4表達增加的抑制作用，進一步證明了白藜蘆醇是通過調控AMPK/NADPH信號通路來抑制NRK細胞增殖與活化。
　　四、白藜蘆醇可以通過減少NADPH氧化酶來源的ROS產生，進而抑制高糖誘導的腎小管上皮細胞轉分化;
　　人腎小管上皮細胞(HK-2)在經高糖誘導48 h后，部分細胞失去了正常的鵝卵石樣形態(tài)變?yōu)殚L梭形。同時Western blot檢測結果提示，高糖作用HK-2細胞后細胞內上皮細胞標志物E-cadherin表達明顯

9、下降，肌成纖維細胞標志物α-SMA表達明顯升高，而白藜蘆醇可以抑制上述細胞表型指標的改變，這說明白藜蘆醇抑制了高糖誘導的HK-2細胞EMT。此外，DCFH-DA檢測提示，與正常對照組相比，高糖可時間依賴性地誘導HK-2細胞內ROS增加。因腎臟ROS的主要來源為NADPH氧化酶，故我們用Westernblot法檢測NADPH氧化酶在HK-2細胞表達的主要亞基，發(fā)現高糖可以時間依賴性地誘導HK-2細胞NOX1、NOX4表達增加。然而，與DP

10、I類似，白藜蘆醇可以明顯抑制高糖引起的細胞內NOX1和NOX4表達增加和ROS產生增多，這說明白藜蘆醇可以通過抑制高糖誘導的NOX1和NOX4依賴的ROS升高，從而抑制HK-2細胞EMT。
　　五、白藜蘆醇通過上調AMPK的信號活性抑制NADPH氧化酶的表達和ROS生成，從而抑制高糖引起的腎小管上皮細胞轉分化;
　　Western blot檢測發(fā)現，高糖可以顯著抑制HK-2細胞內AMPK信號活性，而白藜蘆醇則可抑制高糖誘導的

11、AMPK信號活性降低，但加入AMPK抑制劑Compound C卻阻遏了白藜蘆醇抑制高糖誘導的HK-2細胞EMT和NOX1、NOX4活化的作用，這說明白藜蘆醇是通過調控AMPK/NADPH信號通路來抑制HK-2細胞EMT。
　　六、外源性給予白藜蘆醇可以改善db/db小鼠腎間質纖維化的程度，抑制腎間質成纖維細胞的增殖與活化，白藜蘆醇對糖尿病腎間質纖維化的干預作用可能是通過調控AMPK/NOX4信號通路而實現的;
　　為了明確在

12、糖尿病中白藜蘆醇對腎間質纖維化的作用和體內AMPK/NADPH信號通路的影響，我們以400 mg/kg/d白藜蘆醇喂食2型糖尿病模型db/db小鼠9周后，觀察小鼠生化指標。與野生型小鼠組相比，db/db小鼠血糖、體重及24 h尿蛋白排出量明顯增加，而予以白藜蘆醇干預后的db/db小鼠24小時尿蛋白量較db/db小鼠明顯減少，但血糖和體重不受影響，這說明白藜蘆醇改善糖尿病腎病不依賴于其對血糖、體重的影響。并且，腎臟病理學染色PAS、MAS

13、SON染色證實了白藜蘆醇可以改善db/db小鼠腎間質纖維化的病變程度。對其具體機制進行研究發(fā)現，與野生型小鼠相比，db/db小鼠腎臟間質中不僅正常成纖維細胞標志物FSP-1以及ECM蛋白Fibronectin的表達顯著增高，α-SMA和PCNA免疫熒光雙染陽性的成纖維細胞亦增多，而白藜蘆醇可以抑制db/db小鼠腎臟內的上述改變。以上實驗均說明白藜蘆醇改善糖尿病腎病腎間質纖維化的作用可能與抑制腎間質成纖維細胞增殖、活化有關。
　　為

14、了進一步闡明白藜蘆醇抑制糖尿病腎病腎纖維化的作用機制，我們用Westernblot以及免疫組化檢測了小鼠腎臟內p-AMPK、NOX1、NOX2和NOX4的表達。在體內研究中發(fā)現，db/db小鼠腎臟內p-AMPK表達明顯減少，而NOX4表達明顯增加，并非NOX1、NOX2，說明NOX4是導致糖尿病高糖狀態(tài)下腎臟ROS生成最主要的NADPH氧化酶。在給予白藜蘆醇干預后，db/db小鼠腎臟p-AMPK表達有所增加，而腎臟內NOX4的表達則顯著

15、降低，提示白藜蘆醇可能通過激活AMPK抑制NOX4的表達，從而改善了db/db小鼠的腎間質纖維化。
　　綜上所述，我們的研究表明，高糖可以誘導腎間質成纖維細胞增殖、活化以及腎小管上皮細胞轉分化，其機制可能與高糖抑制了腎間質成纖維細胞和腎小管上皮細胞內AMPK的信號活性，從而促進了NADPH氧化酶來源的ROS增加，最終導致了腎間質成纖維細胞增殖、活化和腎小管上皮細胞EMT有關。白藜蘆醇則可以通過調控AMPK/NADPH信號通路抑制高