β-腎上腺素受體激動劑異丙腎上腺素引起星形膠質細胞ERK磷酸化的信號傳導途徑.pdf

1、在腦內，腎上腺素能和去甲腎上腺素能神經(jīng)元位于腦橋和延髓，分別向上和向下投射神經(jīng)纖維，其支配區(qū)域相當廣泛，包括大腦皮質、邊緣葉、海馬和脊髓。正常狀態(tài)下，對維持腦的功能發(fā)揮重要作用。在病理狀態(tài)時，去甲腎上腺素除了與抑郁癥有關外，目前研究發(fā)現(xiàn)在多發(fā)性硬化病人的腦白質中，星形膠質細胞出現(xiàn)β-腎上腺素受體的丟失；在老年性癡呆的病人，Gs蛋白耦聯(lián)受體細胞內信號傳導系統(tǒng)、cAMP和蛋白激酶A(PKA)功能降低。 神經(jīng)膠質細胞可分為星形膠質細胞

2、、少突膠質細胞和小膠質細胞。其中星形膠質細胞是哺乳動物腦內分布最為廣泛的一類細胞。星形膠質細胞從胞體伸出許多長且有分支的線狀偽足，并黏附在微血管周圍。相鄰星形膠質細胞間有縫隙連接，縫隙連接處狹窄，只允許小分子物質通過。星形膠質細胞是不可興奮型細胞，具有支持、營養(yǎng)神經(jīng)細胞，維持細胞外液離子平衡，構成血腦屏障及合成神經(jīng)活性物質的功能，同時表達多種生物活性物質的受體，并且在免疫調節(jié)中起著重要作用。 上皮生長因子受體(EGFR)的間接激

3、活(Transactivation)是近年來發(fā)現(xiàn)的細胞內/外信號傳導途徑，是細胞根據(jù)外界刺激調節(jié)自身功能的一種巧妙方式。G蛋白耦聯(lián)受體(GPCR)激活或外界刺激，導致某種生長因子的釋放，進而激活自身和相鄰的酪氨酸激酶受體，產(chǎn)生與直接激活酪氨酸激酶(RTK)相似效應的過程。EGFR被配體激活后啟動細胞內信號傳導，經(jīng)過細胞質中銜接蛋白、酶的級聯(lián)反應等，調控細胞遷移、黏附、增殖、分化和凋亡，并且與腫瘤的形成與惡化密切相關。 β-腎上腺

4、素受體激動劑異丙腎上腺素(Isoproterenol)對細胞的調節(jié)具有細胞特異性。在某些細胞異丙腎上腺素能夠引起上皮生長因子受體的激活，而在另一些細胞則抑制細胞外信號調節(jié)激酶(ERK)的磷酸化；即使同樣是β-腎上腺素受體激活所引起的ERK磷酸化，其信號傳導通路也不盡相同。本篇文章主要研究在星形膠質細胞，(1)β-腎上腺素受體激動劑異丙腎上腺素是否引起EGFR的間接激活；(2)異丙腎上腺素引起ERK磷酸化的信號傳導途徑。 方法:

5、 星形膠質細胞取材于新生CD-1小鼠大腦皮層。無菌操作，斷頭剝離腦膜后，取出腦組織。顯微鏡下分離出大腦皮層，切碎后加入培養(yǎng)液充分振蕩1分鐘。分別過100μm和70μm濾膜，放入Falcon Primaria培養(yǎng)皿中。用含有7.5 mM葡萄糖的DMEM培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，每周更換兩次新鮮培養(yǎng)液，培養(yǎng)三周后用于實驗，實驗前一周加入dBcAMP促進細胞分化成熟。首先在培養(yǎng)皿中加入PTX、H-89、GM6001、肝素、AG1478或PP1其中

6、任一種抑制劑，37℃孵育15分鐘。再加入異丙腎上腺素，孵育20分鐘。移出培養(yǎng)液，應用PBS清洗細胞后，加入300μl/皿裂解液收集細胞。勻漿后的樣品進行免疫凝膠電泳半定量測定ERK1/2磷酸化水平。使用SPSS 12.0軟件進行統(tǒng)計分析，多組資料用one-way ANOVA方法進行比較，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。 結果: 1、異丙腎上腺素誘導ERK的磷酸化在星形膠質細胞，異丙腎上腺素引起ERK的磷酸化。異丙腎上

7、腺素濃度為1nM時，p-ERK1/2略有升高，而在10 nM、100 nM、1μM和10μM時，磷酸化水平顯著升高，差異具有統(tǒng)計學意義。并且100 nM異丙腎上腺素引起的ERK磷酸化作用時間較長，10、20和40分鐘后均引起了p-ERK1/2的顯著增高，差異具有統(tǒng)計學意義。 2、Gi蛋白抑制劑的作用0.2μg/ml Gi蛋白抑制劑百日咳毒素(PTX)不能抑制由異丙腎上腺素引起的ERK磷酸化，差異具有統(tǒng)計學意義。表明β-腎上腺素受

8、體激動劑引起的ERK磷酸化與Gi蛋白的βγ亞單位無關。 3、PKA抑制劑的作用5 μM PKA抑制劑H-89不能抑制由異丙腎上腺素引起的ERK磷酸化，差異具有統(tǒng)計學意義。表明β-腎上腺素受體激動劑介導的ERK磷酸化與PKA無關。 4、Epac誘導ERK的磷酸化在星形膠質細胞，10μM Epac1/2特異性激活劑8-pCPT-2'-O-Me-cAMP能夠引起ERK的磷酸化，差異具有統(tǒng)計學意義。表明Epaes及其下游調節(jié)機制

9、參與了β-腎上腺素受體激動劑介導的ERK磷酸化過程。 5、金屬蛋白酶抑制劑和肝素的作用10 μM Zn2+依賴性金屬蛋白酶抑制劑GM6001和1 mg/ml肝素均不能抑制由異丙腎上腺素引起的ERK磷酸化，差異具有統(tǒng)計學意義。表明β-腎上腺素受體激動劑引起的ERK磷酸化與金屬蛋白酶無關，并且也無HB-EGF的剝離釋放。 6、EGFR和Src抑制劑的作用1μM上皮生長因子受體特異性拮抗劑AG1478能夠部分抑制由異丙腎上腺素

10、引起的ERK磷酸化，而10μM Src酪氨酸激酶抑制劑PP1能夠完全抑制此磷酸化過程，差異均具有統(tǒng)計學意義。表明異丙腎上腺素介導的ERK磷酸化，可通過Src酪氨酸激酶直接引起上皮生長因子受體激活，進而引起ERK的磷酸化；并且Src酪氨酸激酶也可能直接激活ERK。 討論: 傳統(tǒng)的cAMP-蛋白激酶途徑是以靶細胞內cAMP濃度改變和激活PKA為主要特征。PKA被cAMP激活后，能在ATP存在的情況下使許多蛋白質特定的絲氨酸和

11、/或蘇氨酸殘基磷酸化，從而調節(jié)細胞的物質代謝和基因表達。最近研究發(fā)現(xiàn)在哺乳動物細胞，cAMP可直接激活PKA和/或Epac1/2。Epae是一種由cAMP直接激活的交換蛋白，能夠進一步激活small GTPases Rap1和Rap2。 與Gi/o和Gq蛋白耦聯(lián)受體所引起的上皮生長因子受體間接激活有所不同，Gs蛋白耦聯(lián)受體激活ERK的信號傳導途徑更為復雜。由不同的G蛋白耦聯(lián)受體激活上皮生長因子受體，其生理功能可完全不同，原因可能

12、有以下兩點：1)上皮生長因子受體激活的強度及持續(xù)時間不同，Gi/o和Gq蛋白耦聯(lián)受體所引起的ERK磷酸化，一般發(fā)生快，持續(xù)時間短，大約在10至20分鐘達高峰，然后很快下降至消失；而cAMP引起的ERK磷酸化持續(xù)時間較長。2)配體與受體結合時，引起EGFR的二聚化作用，EGFR可以形成同型二聚體，也可以和HER2、HER3、HER4形成異型二聚體。 上皮生長因子受體間接激活的信號傳導途徑不僅取決于G蛋白耦聯(lián)受體的種類，而且也依賴于

13、細胞的種類。隨著研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)Gs蛋白耦聯(lián)受體的激活在某些細胞，如PC12細胞，也能引起上皮生長因子受體的激活，而在另一些細胞，如成纖維瘤細胞和血管平滑肌細胞，cAMP則抑制ERK的磷酸化。即使同樣是β2-腎上腺素受體激活所引起的ERK磷酸化，在COS細胞此磷酸化是由β2-腎上腺素受體的Gs蛋白轉變成Gi蛋白所引起，而且不能被cAMP所替代；而在淋巴瘤細胞ERK磷酸化是通過Epae1/Rap1信號通路完成的。在星形膠質細胞情況