腎上腺素能受體激動(dòng)劑引起星形膠質(zhì)細(xì)胞和小鼠腦內(nèi)ERK1-2磷酸化的信號(hào)傳導(dǎo)途徑.pdf

1、本研究分為二部分：
　　 第一部分、α2-腎上腺素能受體激動(dòng)劑右旋美托咪啶引起小鼠腦內(nèi)EGFR間接激活EGFR間接激活包括兩個(gè)階段：第一階段，Gj蛋白同源三聚體βγ亞單位激活，通過(guò)激活蛋白激酶C(PKC)和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)Src酪氨酸激酶，使金屬蛋白酶介導(dǎo)的EGFR配體從跨膜前體外功能區(qū)域脫落釋放。第二階段，脫落釋放的上皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)配體主要是HB-EGF，激活同一細(xì)胞或相鄰細(xì)胞上的EGFR，如EGFR酪氨酸激酶(RTK)磷

2、酸化，從而導(dǎo)致ERK磷酸化。
　　 右旋美托咪啶是α2-腎上腺素能受體激動(dòng)劑，它與α2-腎上腺素能受體特異性結(jié)合力是與α1-腎上腺素能受體結(jié)合的1600倍，也比可樂(lè)定高出幾倍，能激活α2-腎上腺素能受體的三個(gè)亞型（α2A、α2B、α2C受體）。濃度在25～500 nM的右旋美托咪啶可以引起小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞ERK1/2磷酸化，也能引起EGFR磷酸化，EGFR酪氨酸激酶抑制劑AG1478、Zn2+-依賴性金屬蛋白酶抑制劑GM6001

3、和HB-EGF拮抗劑肝素能抑制其引起的EGFR和ERK1/2磷酸化，表明它們都參與間接激活途徑。在小腦顆粒神經(jīng)元右旋美托咪啶不能引起ERK1/2磷酸化，也無(wú)鈣離子濃度升高，表明在谷氨酸能神經(jīng)元缺少突觸后α2-腎上腺素能受體表達(dá)。然而用右旋美托咪啶處理星形膠質(zhì)細(xì)胞，收集其培養(yǎng)液能引起神經(jīng)元ERK1/2磷酸化，說(shuō)明此過(guò)程有EGFR配體釋放。在體內(nèi)HB-EGF能促進(jìn)小腦顆粒神經(jīng)母細(xì)胞增殖，EGF能引起培養(yǎng)的小腦顆粒神經(jīng)元ERK磷酸化升高，說(shuō)明

4、小腦顆粒神經(jīng)元上存在EGFR的表達(dá)。
　　 在培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞右旋美托咪啶能引起EGFR間接激活，但在整體腦內(nèi)右旋美托咪啶是否具有同樣作用。我們將研究：1）腹腔注射右旋美托咪啶是否引起小鼠腦內(nèi)EGFR和ERK1/2磷酸化。2）EGFR和ERK1/2磷酸化是否被EGFR酪氨酸激酶抑制劑AG1478、Zn2+-依賴性金屬蛋白酶抑制劑GM6001和HB-EGF拮抗劑肝素所抑制。
　　 方法：
　　 成年雄性CD-1小

5、鼠，腹腔注射右旋美托咪啶，7min、15min或30min斷頭，取出腦組織在裂解液中勻漿。側(cè)腦室注射AG1478、GM6001或肝素其中一種抑制劑后，腹腔注射右旋美托咪啶15min后斷頭，腦組織在裂解液中勻漿。勻漿后的樣品進(jìn)行免疫凝膠電泳和Westem印跡法半定量檢測(cè)ERK1/2磷酸化和EGFR磷酸化，以及EGFR磷酸化位點(diǎn)。使用SPSS10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，多組資料用one-way ANOVA方法進(jìn)行比較，P

6、有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 1、ERK1/2磷酸化腹腔注射3μg/kg右旋美托咪啶7min后，ERK1/2磷酸化與對(duì)照組相比升高，15min后ERK1/2磷酸化有顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；30min后ERK1/2磷酸化降低。
　　 側(cè)腦室注射終濃度為1μM EGFR酪氨酸激酶抑制劑AG1478、3μM Zn2+-依賴性金屬蛋白酶抑制劑GM6001或1mg/ml HB-EGF拮抗劑肝素，可以抑制腹腔注射

7、3μg/kg右旋美托咪啶引起ERK1/2磷酸化，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 2、EGFR磷酸化腹腔注射3μg/kg右旋美托咪啶15min后，EGFR磷酸化與對(duì)照組相比有顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；應(yīng)用1μM EGFR酪氨酸激酶抑制劑AG1478、3μM Zn2+-依賴性金屬蛋白酶抑制劑GM6001或1mg/ml HB-EGF拮抗劑肝素，可以抑制腹腔注射3μg/kg右旋美托咪啶引起EGFR磷酸化，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　

8、 腹腔注射3μg/kg右旋美托咪啶，可以引起成年小鼠腦內(nèi)除位點(diǎn)Y1068的EGFR位點(diǎn)磷酸化。其中位點(diǎn)Y1173和Y1045磷酸化與對(duì)照組相比無(wú)明顯升高，位點(diǎn)Y845和Y992磷酸化與對(duì)照組相比有顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 討論：
　　 目前研究表明，在培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞和腦片，右旋美托咪啶引起α2-腎上腺素能受體激活具有濃度依賴性。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，EGFR磷酸化同樣可以被相同抑制劑所抑制。在腦內(nèi)和培養(yǎng)的星形膠質(zhì)

9、細(xì)胞，右旋美托咪啶引起Y992位點(diǎn)磷酸化，與c-Src作用有關(guān)，此位點(diǎn)對(duì)于激活Ras非常重要。Y845磷酸化同樣需要c-Src參與。
　　 在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，雖然我們不能斷定右旋美托咪啶選擇性激活腦內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞，但是在培養(yǎng)的谷氨酸能神經(jīng)元，右旋美托咪啶沒(méi)有刺激作用，說(shuō)明其主要作用在星形膠質(zhì)細(xì)胞，可能是因?yàn)樯窠?jīng)元缺少突觸后α2-腎上腺素能受體的表達(dá)。同樣在培養(yǎng)的小腦顆粒神經(jīng)元，右旋美托咪啶不能引起細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度([Ca2+]i)升高

10、。
　　 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，右旋美托咪啶在數(shù)分鐘內(nèi)即可引起腦內(nèi)ERK1/2磷酸化，并在1小時(shí)內(nèi)消失，這與右旋美托咪啶作為肌肉注射麻醉用藥，穿過(guò)血腦屏障，短時(shí)間內(nèi)(12分鐘)達(dá)到最大血漿濃度相一致。實(shí)驗(yàn)中右旋美托咪啶引起腦內(nèi)ERK1/2磷酸化可以完全被肝素抑制，說(shuō)明HB-EGF為唯一釋放的EGFR配體。
　　 在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，激活腦內(nèi)α2-腎上腺素能受體，可導(dǎo)致EGFR配體脫落，通過(guò)旁分泌不僅作用于星形膠質(zhì)細(xì)胞，也作用于神經(jīng)元，EGF

11、能引起培養(yǎng)細(xì)胞ERK1/2磷酸化。中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，EGF、HB-EGF或TGF-α（這三種EGFR配體在培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞上均表達(dá)）可以激活EGFR，腦缺血時(shí)提供神經(jīng)保護(hù)作用。這可能是右旋美托咪啶具有神經(jīng)保護(hù)作用的原因之一。右旋美托咪啶神經(jīng)保護(hù)作用并不是因?yàn)槟芤鹜挥|雕j-a2-腎上腺素能受體激活，引起去甲腎上腺素分泌減少。這種神經(jīng)保護(hù)可能是作用于大量表達(dá)α2A-腎上腺素能受體的星形膠質(zhì)細(xì)胞而發(fā)揮作用。
　　 結(jié)論：
　　

12、 在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，腹腔注射右旋美托咪啶能引起小鼠腦內(nèi)ERK1/2和EGFR磷酸化，此過(guò)程依賴于EGFR間接激活；并且金屬蛋白酶參與此間接激活過(guò)程，能引起細(xì)胞膜上的生長(zhǎng)因子膜外脫落；脫落的生長(zhǎng)因子為HB-EGF，進(jìn)而激活EGFR。
　　 第二部分、異丙腎上腺素引起星形膠質(zhì)細(xì)胞ERK1/磷酸化的信號(hào)傳導(dǎo)途徑具有濃度依賴性β-腎上腺素能受體是由氨基酸序列形成7個(gè)跨膜區(qū)，3個(gè)細(xì)胞外環(huán)和3個(gè)胞漿環(huán)，細(xì)胞外環(huán)氨基酸組成對(duì)受體與配基結(jié)合的穩(wěn)定性

13、有影響作用；跨膜區(qū)氨基酸組成決定受體與配基結(jié)合特性。β-腎上腺素能受體有三種亞型，分別為β1、β2、β3，都屬于Gs蛋白偶聯(lián)受體，刺激這些受體可以增加腺苷酸環(huán)化酶活性，并引起細(xì)胞內(nèi)cAMP聚集。
　　 β-腎上腺素能受體激活引起的經(jīng)典途徑是通過(guò)Gs蛋白和cAMP激活PKA。β-腎上腺素能受體激活引起細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1和2(ERK1/2)磷酸化現(xiàn)象被多次闡述。此過(guò)程是Gi/o或Gq蛋白偶聯(lián)受體引起上皮生長(zhǎng)因子受體(Epiderm

14、al growthfactor receptor，EGFR)間接激活。EGFR間接激活過(guò)程中，Gi/o或Gq蛋白偶聯(lián)受體激活或細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i濃度增加，從而導(dǎo)致金屬蛋白酶催化的EGFR配體如HB-EGF脫落，從而激活EGFR。
　　 β-腎上腺素能受體激活引起ERK1/2磷酸化，也可以不依賴于Gs/Gi蛋白轉(zhuǎn)化和間接激活途徑。激活G蛋白偶聯(lián)受體，形成異源三聚體后，受體被G蛋白偶聯(lián)受體激酶即絲氨酸-蘇氨酸激酶磷酸化，此磷酸化依

15、賴于G蛋白的βγ亞單位。這對(duì)于質(zhì)膜能有效的募集β-arrestins到胞漿區(qū)受體和使G蛋白信號(hào)脫敏有決定性作用。最近研究表明，β-arrestins充當(dāng)多蛋白的支架作用，引起特異信號(hào)通路元素的集合，從而引起信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)放大，其中包括ERK1/2磷酸化。
　　 非依賴Src的β-腎上腺素能受體激活所引起ERK1/2磷酸化，可以通過(guò)Gsα/腺苷酸環(huán)化酶/cAMP通路所介導(dǎo)。腎臟轉(zhuǎn)染β1-腎上腺素能受體的COS-7細(xì)胞證實(shí)，百日咳毒素

16、敏感的Gi蛋白、Src家族酪氨酸激酶、受體間接激活和EGFR不參與其中。同樣如圖6所示，除激活PKA外，cAMP還能結(jié)合到cAMP-調(diào)節(jié)鳥嘌呤轉(zhuǎn)換因子即Epacs上，以非依賴PKA形式激活GTPase和Rap，Rap能與Ras/ERK級(jí)聯(lián)反應(yīng)相互作用。在真核細(xì)胞，Epac介導(dǎo)的β2-腎上腺素的信號(hào)能引起ERK1/2磷酸化。
　　 在星形膠質(zhì)細(xì)胞，β-腎上腺素能受體激活引起的ERK磷酸化信號(hào)傳導(dǎo)途徑并不清楚。目前工作中，我們發(fā)現(xiàn)在

17、原代培養(yǎng)的小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞，異丙腎上腺素引起ERK磷酸化具有濃度依賴性。低濃度(≤100 nM)時(shí)，異丙腎上腺素作用于β2-腎上腺素能受體引起p-arrestins介導(dǎo)的Src激活，從而導(dǎo)致ERK磷酸化，此過(guò)程不包括EGFR酪氨酸激酶；高濃度(≥1μM)時(shí)，異丙腎上腺素作用于β1-腎上腺素能受體引起PKA介導(dǎo)的Gs/Gi蛋白轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致[Ca2+]i濃度增加，從而激活金屬蛋白酶，引起生長(zhǎng)因子脫落，導(dǎo)致EGFR間接激活。
　　 方法

18、：
　　 采用原代培養(yǎng)的小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞。分別用不同濃度異丙腎上腺素以及相關(guān)特異性抑制劑處理細(xì)胞，①檢測(cè)ERK1/2磷酸化水平；②檢測(cè)EGFR磷酸化水平及磷酸化位點(diǎn)；③經(jīng)β-arrestin1和β-arrestin2或Epac1和Epac2的siRNA干擾后，檢測(cè)ERK1/2磷酸化水平；④檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度。使用SPSS10.O軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，多組資料用one-way ANOVA方法進(jìn)行比較，P

19、意義。
　　 結(jié)果：
　　 1、原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞，不同濃度異丙腎上腺素能引起ERK1/2磷酸化，以及異丙腎上腺素作用于β-腎上腺素能受體亞型具有濃度依賴性。
　　 2、原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞，高濃度異丙腎上腺素(≥1μM)引起ERK1/2磷酸化作用在β1-腎上腺素能受體，引起生長(zhǎng)因子脫落和EGFR激活，而低濃度異丙腎上腺素(≤100 nM)與之相反，需要Src參與。
　　 3、原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞

20、，p-arrestin2參與100 nM低濃度異丙腎上腺素引起ERK1/2磷酸化；β-arrestinl和β-arrestin2共同參與1μM高濃度異丙腎上腺素引起ERK1/2磷酸化。
　　 4、原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞，異丙腎上腺素在特異性位點(diǎn)上促進(jìn)EGFR磷酸化。低濃度異丙腎上腺素在EGFR引起Src募集。
　　 5、原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞，1μM異丙腎上腺素引起ERK1/2磷酸化需要細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高、“Gs/Gi

21、蛋白轉(zhuǎn)化”和PKA激活。
　　 6、原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞，Epac不參與異丙腎上腺素引起ERK1/2磷酸化。
　　 7、原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞，異丙腎上腺素引起的ERK1/2磷酸化需要MEK的激活。
　　 討論：
　　 1、納摩爾濃度異丙腎上腺素納摩爾濃度異丙腎上腺素引起ERK1/2磷酸化不能被β1-腎上腺素能受體拮抗劑betaxolol抑制，但能被β2-腎上腺素能受體拮抗劑ICI118551抑制，說(shuō)明

22、納摩爾濃度異丙腎上腺素作用于β2-腎上腺素能受體，并且此過(guò)程不能被EGFR酪氨酸激酶抑制劑AG1478所抑制。說(shuō)明納摩爾濃度異丙腎上腺素激活的信號(hào)傳導(dǎo)通路不包括EGFR間接激活、Gs/Gi蛋白轉(zhuǎn)化、PKA激活和細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i升高及Epac激活，但β-arrestin2、Src和MEK參與此過(guò)程。Src可能通過(guò)β-arrestin2被激活，并反過(guò)來(lái)作用于EGFR，引起ERK磷酸化，此過(guò)程不依賴于EGFR酪氨酸激酶。
　　 納

23、摩爾濃度異丙腎上腺素引起EGFR在Y845和Y1045位點(diǎn)磷酸化，反應(yīng)了Src與EGFR相互作用。Y845主要是與Src調(diào)控有關(guān)的磷酸化位點(diǎn)。Y845磷酸化位點(diǎn)介導(dǎo)與線粒體細(xì)胞色素C氧化酶亞基Ⅱ的結(jié)合，可能與細(xì)胞存活和死亡通路有關(guān)。
　　 2、微摩爾濃度異丙腎上腺素微摩爾濃度異丙腎上腺素引起ERK1/2磷酸化能被β1-腎上腺素能受體拮抗劑betaxolol抑制，說(shuō)明微摩爾濃度異丙腎上腺素可通過(guò)激活β1-腎上腺素能受體引起ERK1

24、/2磷酸化?？梢员籔KA抑制劑H89、Gi蛋白抑制劑百日咳毒素(Pertussis toxin，PTX)、細(xì)胞內(nèi)鈣離子螯合劑BAPTA/AM、Zn2+-依賴性金屬蛋白酶抑制劑GM6001、EGFR酪氨酸激酶抑制劑AG1478、MEK抑制劑U0126和β-arrestin1和β-arrestin2的siRNA抑制，但是不能被Epac的siRNA和Src抑制劑PPI所抑制，說(shuō)明高濃度異丙腎上腺素是通過(guò)PKA、Gs/Gi蛋白轉(zhuǎn)化、細(xì)胞內(nèi)儲(chǔ)庫(kù)[

25、Ca2+]i釋放以及金屬蛋白酶介導(dǎo)的EGFR間接激活和MAPK激活，但是不包括Src。在EGF激活EGFR過(guò)程中引起β-arrestin1和β-arrestin2的招募說(shuō)明，β-arrestins招募是位于EGFR通路下游。同許多G蛋白偶聯(lián)受體(GPCRs)-樣，EGFR可以通過(guò)β-arrestins引起細(xì)胞內(nèi)攝，說(shuō)明EGFR介導(dǎo)的ERK磷酸化參與胞吞過(guò)程中。并且抑制β-arrestinl能顯著減弱EGFR介導(dǎo)的MAPK活性。
　

26、　 除Y845和Y1045磷酸化位點(diǎn)外，微摩爾濃度異丙腎上腺素還引起Y1173位點(diǎn)磷酸化，當(dāng)異丙腎上腺素濃度增加時(shí)，Y845和Y1045位點(diǎn)磷酸化沒(méi)有進(jìn)一步的升高。Y1173主要是與Shc相互作用的位點(diǎn)，從而激活MAPK即Ras-Raf-MEK-ERK通路。
　　 3、兩條通路的激活微摩爾濃度異丙腎上腺素即能激活G蛋白又能激活β-arrestins介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)。雖然我們并不清楚ERK1/2下游信號(hào)的功能，但β2-腎上腺素能受

27、體和EGF激活的下游信號(hào)效應(yīng)，依賴于Y992、Y1173、Y845的共磷酸化。DNA合成和有絲分裂活性除需要EGF或引起G蛋白偶聯(lián)受體間接激活的激動(dòng)劑外，也需要位點(diǎn)Y845磷酸化。在小鼠胚胎成纖維細(xì)胞，β2-腎上腺素能受體可以激活兩種信號(hào)傳導(dǎo)途徑，高濃度腎上腺素可以通過(guò)較理想的途徑進(jìn)行DNA合成。
　　 4、星形膠質(zhì)細(xì)胞和β-腎上腺素能受體星形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)許多神經(jīng)遞質(zhì)的受體，并在維持腦功能中扮演重要角色。β-腎上腺素能受體在星形

28、膠質(zhì)細(xì)胞廣泛表達(dá)。近二十年它們的功能被大量研究。目前為止，尤其是Gs蛋白介導(dǎo)的功能例如糖原分解，在腦內(nèi)能量代謝起重要作用，并有助于學(xué)習(xí)和記憶。在體內(nèi)試驗(yàn)，高濃度異丙腎上腺素能使小鼠腦內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞[Ca2+]i濃度升高，提示腦內(nèi)β-腎上腺素能受體可以引起Gs/Gi蛋白轉(zhuǎn)化，在成熟腦內(nèi)其功能并不清楚，但在培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞，與異丙腎上腺素同樣能增加細(xì)胞內(nèi)cAMP的dBcAMP，可以引起細(xì)胞發(fā)育上顯著改變，包括星狀突起的延伸和膠質(zhì)酸性蛋白表

29、達(dá)的增加。這些作用同樣能被PKA抑制劑H89、Zn2+-依賴性金屬蛋白酶抑制劑GM6001和EGFR酪氨酸激酶抑制劑AG1478所抑制，說(shuō)明此過(guò)程有Gs/Gi蛋白轉(zhuǎn)化、EGFR配體釋放及EGFR激活。但不能被Src抑制劑PP1所抑制，說(shuō)明β-arrestins/Src并不參與此通路。這與圖6中β1-腎上腺素能受體激活介導(dǎo)的傳導(dǎo)通路是一致的。
　　 結(jié)論：
　　 在星形膠質(zhì)細(xì)胞，異丙腎上腺素引起ERK1/2磷酸化升高的信號(hào)