α腎上腺素能受體激動(dòng)對(duì)TLR4信號(hào)通路影響的研究.pdf

1、目的：研究α腎上腺素能受體激動(dòng)對(duì)人外周血單核細(xì)胞TLR4信號(hào)通路及其中相關(guān)因子變化影響，探討α腎上腺素能受體與TLR4的相互作用及其調(diào)控機(jī)制。
　　 方法：采集健康青年人外周靜脈血，進(jìn)行離體實(shí)驗(yàn)。(一)觀(guān)察不同劑量α受體激動(dòng)劑去甲腎上腺素(Norepinephrine，NE)對(duì)人外周血單核細(xì)胞TLR4蛋白及mRNA、P38mRNA、NF-κBp65的影響及上清中炎癥因子IL-6、IL-18的變化，選取10例健康青年人各抽取外周靜

2、脈血32ml，經(jīng)EDTA抗凝后每份血均分為空白組、25μmol/L去甲腎上腺組、50μmol/L去甲腎上腺組、75μmol/L去甲腎上腺組，孵育18h后，用ELISA法測(cè)定血液離心后上清液中IL-6、IL-18的濃度，分離單核細(xì)胞后用流式細(xì)胞儀測(cè)定CD14+單核細(xì)胞TLR4陽(yáng)性細(xì)胞百分率，提取RNA后采用RT-PCR測(cè)定TLR4mRNA及P38mRNA的表達(dá)，免疫組化法測(cè)定NF-κBp65蛋白的表達(dá)；(二)利用siRNA干擾技術(shù)使TLR

3、4mRNA保持靜默，觀(guān)察用α受體激動(dòng)劑NE刺激后相關(guān)因子濃度變化情況，選取10例健康人各抽取外周靜脈血16ml，經(jīng)EDTA抗凝后每份血均分為空白組、75μmol/L去甲腎上腺組、1nmolScramble siRNA+0.24ml轉(zhuǎn)染液組、1nmol TLR4 siRNA+0.24ml轉(zhuǎn)染液組，轉(zhuǎn)染18h后用ELISA法測(cè)定血液離心后上清液中IL-6、IL-18的濃度，分離單核細(xì)胞后爬片培養(yǎng)，免疫組化法測(cè)定NF-κBp65蛋白的表達(dá)。(

4、三)利用不同阻滯劑分別阻斷α受體、P38MAPK、PKA、PKC后，再用α受體激動(dòng)劑NE刺激，觀(guān)察TLR4蛋白表達(dá)量的變化，選取10例健康青年人各抽取外周靜脈血6ml，經(jīng)EDTA抗凝后每份血均分為25μmol/Lα受體阻滯劑酚妥拉明組、15μmol/L P38MAPK抑制劑SB202190組、15μmol/L pKA抑制劑H89組、15μmol/L pKC抑制劑Go6983組，并設(shè)空白對(duì)照組、75μmol/L去甲腎上腺組，孵育0.5h后

5、，再加入75μmol/LNE孵育18h后，采用流式細(xì)胞儀測(cè)定CD14+單核細(xì)胞TLR4陽(yáng)性細(xì)胞百分率。
　　 結(jié)果：1、應(yīng)用不同濃度的α受體激動(dòng)劑NE刺激人外周血單核細(xì)胞后，TLR4蛋白及mRNA、P38mRNA、核內(nèi)NF-κBp65蛋白、上清中IL-6及IL-18的表達(dá)呈劑量依賴(lài)性升高：NE75組、NE50組分別與空白組及NE25組比較均明顯升高，(p＜0.05，p＜0.01)，NE75組與NE50組比較明顯升高(p＜0.05

6、)，NE25組與空白組比較無(wú)明顯升高(p＞0.05)；2、TLR4mRNA干擾后α受體激動(dòng)劑NE刺激血液離心后上清液中IL-6及IL-18、單核細(xì)胞NF-κB P65蛋白的表達(dá)為：Si+NE75組均明顯低于空白組、Sc+NE75組及NE75組(P＜0.05)；3、分別阻斷α受體、P38MAPK、PKA、PKC后，用有效濃度NE(75μmol/L)刺激外周血單核細(xì)胞，觀(guān)察TLR4蛋白的表達(dá)量為：α-blocker組、P38組、PKA組與N