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1、目的:肺纖維化是一種原因不明的進(jìn)展性、致死性肺間質(zhì)性疾病。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)在肺纖維化過程中扮演了重要角色,其不僅能激活下游Smad信號(hào)通路進(jìn)而誘導(dǎo)上皮細(xì)胞-間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化,還能調(diào)控各種細(xì)胞因子加劇細(xì)胞外基質(zhì)的沉積。本課題擬在前期研究基礎(chǔ)之上,采用疏通肺絡(luò)治法,觀察艾灸(肺俞、膏肓俞)在治療博萊霉素誘導(dǎo)肺纖維化模型大鼠的過程中,對(duì)TGF-β信號(hào)通路關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)的調(diào)控機(jī)制,為提高防治肺纖維化療效提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
方
2、法:3月齡SPF級(jí)健康SD大鼠88只,雄性,體重180±20g。將大鼠隨機(jī)分組,每組8只:正常組(N);模型(M)組:模型7天(M7)組、模型11天(M11)組、模型23天(M23)組、模型35天(M35)組;艾灸組(A):艾灸11天(A11)組、艾灸23天(A23)組、艾灸35天(A35)組;陽(yáng)性對(duì)照潑尼松組(P)組:潑尼松11天(P11)組、潑尼松23天(P23)組、潑尼松35天(P35)組。除正常組按造模方法予以氣管內(nèi)一次性注射等
3、體積的生理鹽水外,其他組均按照氣管內(nèi)一次性注入博萊霉素5mg/Kg方法復(fù)制肺纖維化模型。造模后第2天開始治療,潑尼松組給予潑尼松混懸液灌胃,艾灸組給予艾灸肺俞和膏肓俞,模型組與艾灸組采取同樣的抓取固定方法,正常組不予干預(yù)。逐日觀察并記錄大鼠呼吸、毛色、精神狀態(tài)、活動(dòng)性及體重變化等一般情況。分別于第7、11、23、35天四個(gè)時(shí)間點(diǎn)取材,動(dòng)態(tài)觀察肺纖維化過程中TGF-β信號(hào)通路誘導(dǎo)上皮細(xì)胞-間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化和細(xì)胞外基質(zhì)的變化。取大鼠右肺組織稱
4、取其濕重并計(jì)算其肺系數(shù),ELISA測(cè)定肺組織羥脯氨酸(HYP)水平。HE和MASSON染色觀察艾灸對(duì)肺纖維化模型大鼠組織形態(tài)的影響。通過ELISA法檢測(cè)大鼠肺組織中TGF-β的表達(dá)水平,實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)上皮細(xì)胞標(biāo)記物E-鈣黏蛋白(E-cad),間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物α-平滑肌蛋白(α-SMA)、波形蛋白(Vim)等基因mRNA表達(dá)的動(dòng)態(tài)改變,探討艾灸對(duì)TGF-β通路介導(dǎo)上皮細(xì)胞-間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的調(diào)控機(jī)制。采用ELISA法檢測(cè)細(xì)胞外基質(zhì)主
5、要成分(COL-Ⅰ、COL-III、HA、LN)含量;實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)肺組織金屬基質(zhì)蛋白酶2(MMP-2)/金屬基質(zhì)蛋白酶9(MMP-9)及金屬基質(zhì)蛋白酶組織抑制劑1(TIMP-1)/金屬基質(zhì)蛋白酶組織抑制劑2(TIMP-2)基因表達(dá)水平;免疫組化法檢測(cè)Ⅰ型膠原、III型膠原蛋白表達(dá)情況,系統(tǒng)深入地探討艾灸對(duì)肺纖維化模型大鼠肺組織細(xì)胞外基質(zhì)主要成分代謝的調(diào)節(jié)作用機(jī)制。
結(jié)果:1.艾灸組動(dòng)物一般狀況較模型組有較大改善。正
6、常組大鼠呼吸均勻平穩(wěn),毛發(fā)光亮,精神較好,反應(yīng)靈敏,體重正常持續(xù)增長(zhǎng);模型大鼠呼吸急促,皮毛無光澤,精神萎靡,唇甲青紫,弓背蜷縮,反應(yīng)差,體重較治療組和正常組增長(zhǎng)緩慢;經(jīng)艾灸治療后,艾灸組比模型組一般情況有較大改善,潑尼松組與艾灸組無明顯差異。
2.艾灸組肺系數(shù)及肺組織羥脯氨酸含量有明顯降低。與正常組相比,模型組和治療組經(jīng)造模后各組肺系數(shù)明顯升高,且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。模型23天組和35天組肺系數(shù)較艾灸組高,但不具統(tǒng)
7、計(jì)學(xué)意義,且艾灸在35天治療結(jié)束后肺系數(shù)最為接近正常組。模型組、艾灸組和潑尼松組肺組織羥脯氨酸含量均顯著大于正常組,且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),與同期模型組比,艾灸組、潑尼松組肺組織羥脯氨酸含量均有明顯降低,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),經(jīng)治療35天后艾灸組肺組織羥脯氨酸含量有明顯降低與正常組最為接近。
3.病理觀察發(fā)現(xiàn),艾灸組炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和膠原纖維增生明顯減弱。HE染色和MASSON染色結(jié)果顯示:正常組肺組織結(jié)構(gòu)完整,肺
8、泡間隔未見增厚、水腫、炎癥及纖維化表現(xiàn),肺泡腔內(nèi)未見明顯滲出,肺組織比較正常。模型7天組肺間質(zhì)內(nèi)見巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤(rùn),肺間質(zhì)增寬。模型11天組肺泡壁增厚明顯,肺泡間質(zhì)內(nèi)仍可見大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。模型23天組部分肺泡融合,肺泡間質(zhì)內(nèi)可見大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和膠原纖維增生。模型35天組間質(zhì)中度增厚,肺間質(zhì)內(nèi)可見大量纖維細(xì)胞。模型組、艾灸組潑和尼松組肺泡炎程度和肺纖維化程度較正常組嚴(yán)重,艾灸35天組膠原纖維沉積較潑尼松組、模型組
9、減少。
4.艾灸對(duì)肺纖維化模型大鼠肺組織上皮細(xì)胞-間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化有顯著抑制作用。肺纖維化模型大鼠肺組織TGF-β含量在11天達(dá)到高峰,與正常組比較有顯著性差異(P<0.05),艾灸組和潑尼松組TGF-β含量較模型組明顯降低,艾灸組在11天和23天時(shí)跟模型組比有顯著差異(P<0.05)。模型7天組E-cad的mRNA表達(dá)量明顯下降,與正常組比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);11天和23天艾灸組與模型組E-cad的mRNA表達(dá)量比較
10、,艾灸組表達(dá)量明顯高于模型組,且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);35天組艾灸組與模型組不具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。模型組和艾灸組α-SAM和vimentin的mRNA表達(dá)趨勢(shì)大致相似:均從11天到23天呈上升趨勢(shì),23天至35天呈下降趨勢(shì)。且艾灸組上升和下降的幅度均小于模型組。且模型組各時(shí)間點(diǎn)α-SAM和vimentin的mRNA表達(dá)量均高于艾灸組和潑尼松組。
5.艾灸顯著性抑制肺纖維化模型大鼠肺組織細(xì)胞外基質(zhì)合成與沉積。主
11、要成分:模型7天組大鼠肺組織中HA和LN水平較正常組明顯升高,且有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),在艾灸治療35天后艾灸組HA和LN水平均低于模型組;模型組大鼠肺組織COL-Ⅰ、COL-Ⅲ含量隨著時(shí)間的推移大致呈升高的趨勢(shì)。與正常組相比,模型7天組大鼠肺組織COL-Ⅰ、COL-Ⅲ含量均明顯升高;與模型組相比,艾灸組、潑尼松治療組在11天和35天治療階段大鼠肺組織COL-Ⅰ、COL-Ⅲ含量降低,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。模型組、艾灸
12、組相同時(shí)間點(diǎn)MMP-2和MMP-9的mRNA表達(dá)趨勢(shì)大致相同。艾灸組MMP-2和MMP-9的mRNA含量較同期模型組低。11天和23天時(shí),同期模型組MMP-9的mRNA表達(dá)量比艾灸組高,均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。模型組TIMP-1和TIMP-2mRNA表達(dá)量從7天起持續(xù)升高至23天達(dá)到最高,與正常組比較差異顯著。模型組TIMP-1和TIMP-2的mRNA表達(dá)量較艾灸組高,艾灸和潑尼松11天治療組TIMP-1mRNA表達(dá)量與模型組比
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