石蓮花對TGF-β1誘導(dǎo)的體外肺纖維化細(xì)胞模型的影響.pdf

1、目的:
　　觀察石蓮花溶液(Graptopetalum solution，GP)對轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growthfactor beta-1，TGF-β1)介導(dǎo)的人Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞和人肺成纖維細(xì)胞系HLF細(xì)胞所構(gòu)建的體外肺纖維化細(xì)胞模型的影響，探討石蓮花溶液是否具有抗肺纖維化的作用。
　　方法:
　　第一部分，采用TGF-β1（5 ng/mL）刺激人Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞

2、構(gòu)建體外肺纖維化模型，通過形態(tài)學(xué)觀察、熒光定量PCR、Western-blot及免疫組化分析A549細(xì)胞中E鈣蛋白(E-Cadherin，E-Cad)、Ⅰ型膠原蛋白(CollagenⅠ，Col-Ⅰ)和纖維連接蛋白(Fibronectin，F(xiàn)N)mRNA及其蛋白的表達(dá)來鑒定模型。進(jìn)而，分別對纖維化模型A549細(xì)胞給予石蓮花溶液(1250μg/mL)干預(yù)并以地塞米松(Dexamethasone，DXM)（120μg/mL）作為陽性對照，干預(yù)

3、時間均為48、72h，MTT法檢測干預(yù)后各組A549細(xì)胞的增殖情況，流式細(xì)胞技術(shù)檢測各組A549細(xì)胞的凋亡情況，熒光定量PCR、Western-blot和免疫組化檢測各組A549細(xì)胞E-Cad、Col-Ⅰ和FN的mRNA及蛋白的表達(dá)情況。之后，運用熒光定量PCR、Western-blot和免疫組化檢測石蓮花對TGF-β1誘導(dǎo)的Smad信號通路相關(guān)蛋白Smad2、Smad4和Smad7的mRNA及蛋白的表達(dá)影響。
　　第二部分，采用

4、TGF-β1(5 ng/mL)刺激人肺成纖維細(xì)胞系HLF細(xì)胞構(gòu)建體外肺纖維化模型，通過熒光定量PCR、Western-blot及免疫組化分析HLF細(xì)胞中α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)、Col-Ⅰ和FN mRNA及其蛋白的表達(dá)來鑒定模型。進(jìn)而，分別對纖維化模型HLF細(xì)胞給予石蓮花溶液（650μg/mL）干預(yù)并以地塞米松(120μg/mL)作為陽性對照，干預(yù)時間均為48、72h，MTT法檢測干預(yù)

5、后各組HLF細(xì)胞的增殖情況，流式細(xì)胞技術(shù)檢測各組HLF細(xì)胞的凋亡情況，熒光定量PCR、Western-blot和免疫組化檢測各組HLF細(xì)胞α-SMA、Col-Ⅰ和FN的mRNA及蛋白的表達(dá)情況。之后，運用熒光定量PCR、Western-blot和免疫組化檢測石蓮花對TGF-β1誘導(dǎo)的Smad信號通路相關(guān)蛋白Smad2、Smad4和Smad7的mRNA及蛋白的表達(dá)影響。
　　結(jié)果:
　　A549細(xì)胞經(jīng)5 ng/mL TGF-β

6、1作用7天后細(xì)胞間隙增寬，細(xì)胞形態(tài)呈間質(zhì)細(xì)胞的紡錘體形狀樣改變;與常規(guī)培養(yǎng)的A549細(xì)胞比較，E-Cad mRNA及其蛋白的表達(dá)明顯下調(diào)(P＜0.05或P＜0.01)，而Col-Ⅰ和FNmRNA及其蛋白的表達(dá)則顯著上調(diào)(P＜0.05或P＜0.01)，具有纖維化細(xì)胞的特征。石蓮花溶液和地塞米松對纖維化模型A549細(xì)胞的增殖均具有抑制作用（IC50=1249.617μg/mL和118.713μg/mL），并促進(jìn)其凋亡（與模型組比較，P＜0.

7、05或P＜0.01），還可上調(diào)E-Cad mRNA及其蛋白的表達(dá)水平（與未干預(yù)組比較均為P＜0.05或P＜0.01），而下調(diào)Col-Ⅰ及FNmRNA及其蛋白的表達(dá)水平（與未干預(yù)組比較均為P＜0.05或P＜0.01）;比較二者的干預(yù)效果，石蓮花溶液上調(diào)E-Cad表達(dá)水平及下調(diào)Col-Ⅰ及FN表達(dá)水平的作用不及地塞米松，但干預(yù)72h二者間基因及蛋白的表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。石蓮花溶液和地塞米松均可下調(diào)Smad2和Smad4 m

8、RNA及其蛋白的表達(dá)水平（與未干預(yù)組比較均為P＜0.01），并上調(diào)Smad7 mRNA及其蛋白的表達(dá)水平（與未干預(yù)組比較均為P＜0.01）;比較二者的干預(yù)效果，石蓮花溶液下調(diào)Smad2和Smad4表達(dá)水平及上調(diào)Smad7表達(dá)水平的作用不及地塞米松，但干預(yù)72h二者間蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。
　　HLF細(xì)胞經(jīng)5 ng/mL TGF-β1作用7天后，與常規(guī)培養(yǎng)的HLF細(xì)胞比較，α-SMA、Col-Ⅰ和FN mRNA及

9、其蛋白的表達(dá)則顯著上調(diào)(P＜0.05或P＜0.01)。石蓮花溶液和地塞米松對纖維化模型HLF細(xì)胞的增殖均具有抑制作用（IC50=647.620μg/mL和117.939μg/mL），并促進(jìn)其凋亡（與模型組比較，P＜0.01），還可下調(diào)α-SMA、Col-Ⅰ及FN mRNA及其蛋白的表達(dá)水平（與未干預(yù)組比較均為P＜0.05或P＜0.01）;比較二者的干預(yù)效果，石蓮花溶液下調(diào)α-SMA、Col-Ⅰ及FN表達(dá)水平的作用不及地塞米松，但干預(yù)72

10、h除石蓮花溶液對FN蛋白的調(diào)節(jié)，二者間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。石蓮花溶液和地塞米松均可下調(diào)Smad2和Smad4 mRNA及其蛋白的表達(dá)水平（與未干預(yù)組比較均為P＜0.05或P＜0.01），并上調(diào)Smad7 mRNA及其蛋白的表達(dá)水平（與未干預(yù)組比較均為P＜0.05或P＜0.01）;比較二者的干預(yù)效果，石蓮花溶液下調(diào)Smad2和Smad4表達(dá)水平及上調(diào)Smad7表達(dá)水平的作用不及地塞米松，但干預(yù)72h二者間蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計

11、學(xué)意義（P＞0.05）。
　　結(jié)論:
　　(1) TGF-β1可介導(dǎo)人Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化和增殖，也可介導(dǎo)人肺成纖維細(xì)胞系HLF細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的活化和增殖，表明，兩種類型細(xì)胞的體外肺纖維化模型構(gòu)建成功。
　　(2)石蓮花溶液可抑制TGF-β1誘導(dǎo)的人Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞的增殖，促進(jìn)該細(xì)胞凋亡，并可抑制該細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)。
　　(3)石蓮花溶液能夠抑制由TGF-β1介導(dǎo)的