TGF-β1在百草枯中毒誘導(dǎo)肺纖維化中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、[研究背景]
　　“肺纖維化”是“彌漫性間質(zhì)性肺疾?。ㄩg質(zhì)性肺疾病）的簡(jiǎn)稱，是一組慢性進(jìn)行性破壞性肺間質(zhì)疾病。病理特征:肺泡壁呈慢性炎癥和與肺間質(zhì)纖維化改變。其中臨床最常見(jiàn)為特發(fā)性肺纖維化患者，占所有肺纖維化的65％。影像學(xué)表現(xiàn):胸膜下肺組織呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，或出現(xiàn)蜂窩狀改變，雙下肺表現(xiàn)明顯，可出現(xiàn)磨玻璃影改變[1]。關(guān)于肺纖維化的發(fā)病機(jī)制，目前尚未完全闡明。既往有研究表明肺損傷后在肺泡上皮修復(fù)的過(guò)程中，出現(xiàn)了肺間質(zhì)細(xì)胞的遷移、增殖及活

2、化，導(dǎo)致成纖維細(xì)胞灶的形成，引起細(xì)胞外基質(zhì)大量分泌并蓄積引起肺間質(zhì)增寬，以上過(guò)程為不可逆性破壞[2]。
　　肺纖維化作為呼吸系統(tǒng)四大病種之一，病因多種多樣，比如物理因素、感染性因素、血管性因素等。在臨床工作中，隨著農(nóng)藥百草枯的廣泛使用，百草枯中毒在臨床急癥中頻發(fā)，百草枯中毒導(dǎo)致肺纖維化患者逐漸增加。
　　百草枯(PQ)，目前應(yīng)用最廣的有機(jī)雜環(huán)類除草劑，商品名為克無(wú)蹤，化學(xué)成分為1，1'-二甲基-4，4'-聯(lián)吡啶二氯化物。臨床

3、中口服百草枯后經(jīng)胃腸道吸收率為5-15％，百草枯吸收后可分布于全身組織器官，由于肺泡上皮細(xì)胞的主動(dòng)攝取功能，故肺組織中濃度最高，肺組織濃度可達(dá)到血液組織濃度的10-90倍，中毒患者1周內(nèi)主要表現(xiàn)以急性肺水腫為主，1周后可出現(xiàn)肺纖維化改變，并且逐漸加重，2-3周達(dá)到高峰，形成明顯纖維化。肺臟作為百草枯中毒的主要靶器官，是目前百草枯中毒死亡的主要原因。大量中毒患者多死于早期肺損傷所導(dǎo)致的急性呼吸窘迫綜合癥(ARDS)，晚期死亡原因多為百草枯

4、中毒引起的肺纖維化[3]。
　　急性百草枯中毒(acute paraquat poisoning，APP)導(dǎo)致肺纖維化既往相關(guān)研究發(fā)現(xiàn):急性百草枯中毒后百草枯于肺泡上皮細(xì)胞大量蓄積，引起肺泡上皮細(xì)胞損傷與間質(zhì)細(xì)胞增生，成為目前急性百草枯中毒肺纖維化研究熱點(diǎn)。以上發(fā)生過(guò)程中出現(xiàn)成上皮細(xì)胞數(shù)量降低，形態(tài)改變，纖維細(xì)胞的數(shù)量明顯增加，從而引起肺組織纖維化發(fā)生[4]。細(xì)胞因子(CK)網(wǎng)絡(luò)失衡學(xué)說(shuō)在急性百草枯中毒發(fā)病機(jī)制中起重要作用，在眾多

5、細(xì)胞因子中，TGF-β1公認(rèn)為始動(dòng)因子。研究發(fā)現(xiàn)，以百草枯刺激A549細(xì)胞，可觀察到百草枯上皮細(xì)胞與間質(zhì)細(xì)胞形態(tài)變化，以及TGF-β1含量明顯增高，證實(shí)TGF-β1可能是百草枯誘導(dǎo)肺纖維化過(guò)程中的關(guān)鍵因子[5]。在肺纖維化發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，上皮細(xì)胞標(biāo)志性蛋白與間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志性蛋白表達(dá)的含量變化[6-9]，可作為證實(shí)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的重要依據(jù)。
　　本研究的第一部分:跟蹤急性百草枯中毒患者雙肺CT變化，篩選肺纖維化患者為研究對(duì)象，

6、按時(shí)間點(diǎn)留取血液標(biāo)本，檢測(cè)百草枯中毒患者血清中炎性因子TGF-β1的含量變化，分析肺纖維化與炎性因子變化的相關(guān)性。第二部分:選擇A549細(xì)胞作為研究對(duì)象，通過(guò)TGF-β1、百草枯分別刺激A549細(xì)胞制造EMT的細(xì)胞模型，討論TGF-β1與百草枯導(dǎo)致肺纖維化機(jī)制。第三部分:選擇小鼠為研究對(duì)象，通過(guò)給予小鼠鼻飼百草枯建立肺纖維化動(dòng)物模型，從組織學(xué)及蛋白表達(dá)分子水平檢測(cè)TGF-β1在肺纖維化發(fā)病中的表達(dá)變化來(lái)預(yù)測(cè)可能的肺纖維化機(jī)制。
　

7、　目前為止，急性百草枯中毒仍無(wú)有效的治療方法，臨床死亡率居高不下，造成極大的經(jīng)濟(jì)損失。因此，探索急性百草枯中毒機(jī)制，明確治療靶點(diǎn)，將為百草枯中毒臨床治療指引方向。
　　[實(shí)驗(yàn)方法與研究?jī)?nèi)容]
　　第一部分:急性百草枯中毒患者血液中炎癥指標(biāo)變化。
　　選取2015.01-2016.01因急性百草枯中毒就診于濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院患者，服藥24小時(shí)內(nèi)，年齡18歲-60歲，每7天復(fù)查雙肺CT了解肺部影像學(xué)進(jìn)展情況，檢測(cè)3小時(shí)、5

8、1小時(shí)、147小時(shí)內(nèi)血漿中E-cadhern、α-SMA、TGF-β1濃度變化。
　　第二部分:細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究百草枯與TGF-β1導(dǎo)致肺纖維化的作用及分子機(jī)制。
　　共設(shè)置四個(gè)實(shí)驗(yàn)組:空白對(duì)照組、百草枯處理組、TGF-β1誘導(dǎo)組、百草枯+TGF-β1阻斷組。外源性TGF-β1組、百草枯溶液組、百草枯+ TGF-β1阻斷劑組，分別刺激A549細(xì)胞，觀察A549細(xì)胞形態(tài)變化，免疫熒光與Western Blotting檢測(cè)顯示細(xì)胞表

9、面上皮標(biāo)志性蛋E-Cadherin與間質(zhì)標(biāo)志性蛋白α-SMA表達(dá)情況。
　　第三部分:動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究TGF-β1在百草枯中毒導(dǎo)致小鼠肺纖維化發(fā)病中的作用及機(jī)制。
　　60只雄性小鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物組（P組）、生理鹽水對(duì)照組（N組）。P組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均給予百草枯80mg/kg，用生理鹽水稀釋至1ml后一次性灌胃染毒。N組采用生理鹽水80mg/kg灌胃，實(shí)驗(yàn)日期以動(dòng)物灌胃造模試驗(yàn)當(dāng)天為實(shí)驗(yàn)0天，實(shí)驗(yàn)第1天、3天、7天、14天、21天分

10、別處死6只動(dòng)物，血漿行ELISA檢查檢測(cè)E-cadhern、α-SMA、TGF-β1水平，HE染色觀察肺組織形態(tài)變化，電鏡觀察上皮細(xì)胞形態(tài)變化及膠原沉積現(xiàn)象，選取TGF-β1、上皮細(xì)胞標(biāo)志性蛋白(E-cadherin)、間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志性蛋白(a-SMA)作為檢測(cè)對(duì)象行免疫組化檢查。結(jié)果顯示:隨著中毒時(shí)間的延長(zhǎng)，與N組比較，P組TGF-β1表達(dá)增高，證實(shí)TGF-β1在肺纖維化早期起促進(jìn)肺纖維化發(fā)展的作用。組織學(xué)檢查證實(shí)急性百草枯中毒后肺泡上

11、皮細(xì)胞形態(tài)改變，表達(dá)下降，間質(zhì)細(xì)胞表達(dá)上升，膠原蛋白沉積，證實(shí)肺纖維化模型成功。
　　[實(shí)驗(yàn)結(jié)果]
　　1.急性百草枯中毒患者肺部影像學(xué)改變與血漿中TGF-β1、E-cadhern、α-SMA含量。
　　研究表明急性百草枯中毒致肺纖維化患者與對(duì)照組比較，中毒3小時(shí)TGF-β1含量無(wú)明顯變化，51小時(shí)、147小時(shí)血漿中TGF-β1含量明顯增加，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在中毒早期TGF-β1含量逐漸增高與雙肺CT肺纖維化進(jìn)程一致，說(shuō)

12、明TGF-β1可能參與并促進(jìn)肺纖維化的進(jìn)程。急性百草枯中毒患者血漿中E-Cadherin含量于3小時(shí)、51小時(shí)與對(duì)照組比較無(wú)明顯降低，第147小時(shí)比較明顯降低，說(shuō)明隨著時(shí)間延長(zhǎng)，上皮細(xì)胞標(biāo)志蛋白表達(dá)降低。與此相反，α-平滑肌肌動(dòng)蛋白含量于第3小時(shí)比較無(wú)明顯變化，51小時(shí)、147小時(shí)比較明顯增高，說(shuō)明隨著時(shí)間延長(zhǎng)，間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志性蛋白逐漸增多。
　　2.細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究百草枯與TGF-β1導(dǎo)致肺纖維化的作用及分子機(jī)制。
　　研究表明

13、在A549細(xì)胞培養(yǎng)液中分別加入TGF-β1，百草枯，百草枯+TGF-β1阻斷劑。TGF-β1組可見(jiàn)A549細(xì)胞形態(tài)變化，由立方形或三角形轉(zhuǎn)變成長(zhǎng)梭形，細(xì)胞呈索條狀松散分布，即細(xì)胞發(fā)生了EMT現(xiàn)象;百草枯組細(xì)胞同樣發(fā)生了EMT現(xiàn)象，但細(xì)胞形態(tài)變化不如TGF-β1誘導(dǎo)組顯著。百草枯+TGF-β1阻斷組細(xì)胞形態(tài)改變較百草枯組減輕。免疫熒光與Western Blotting檢測(cè):TGF-β1組、百草枯組E-Cadherin表達(dá)減少，α-SMA表

14、達(dá)增加，百草枯+TGF-β1阻斷組變化較前兩組減輕。以上結(jié)果說(shuō)明TGF-β1作為肺纖維化的始動(dòng)因子可啟動(dòng)肺纖維化進(jìn)程，百草枯可能通過(guò)誘導(dǎo)A549細(xì)胞產(chǎn)生TGF-β1從而發(fā)生肺纖維化，TGF-β1阻斷組可抑制百草枯導(dǎo)致肺纖維化的發(fā)展。
　　3.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究TGF-β1在百草中毒導(dǎo)致誘導(dǎo)小鼠肺纖維化發(fā)病中的作用及機(jī)制。
　　(1)研究表明急性百草枯中毒小鼠血漿中TGF-β1含量于第1、3、7、14天明顯增高，21天比較無(wú)意義。急

15、性百草枯小鼠患者血漿中E-Cadherin含量于第14、21天時(shí)與對(duì)照組比較明顯降低，說(shuō)明隨著時(shí)間延長(zhǎng)，上皮細(xì)胞表達(dá)降低。α-平滑肌肌動(dòng)蛋白含量于第7、14、21天比較明顯增高，說(shuō)明隨著時(shí)間延長(zhǎng)，間質(zhì)細(xì)胞逐漸增多。
　　(2)HE染色表現(xiàn)急性百草枯中毒小鼠肺泡間隔破壞，增寬，肺泡內(nèi)見(jiàn)滲出物與血細(xì)胞。
　　(3)電鏡觀察急性百草枯中毒小鼠肺泡上皮細(xì)胞破壞明顯，肺間質(zhì)明顯增寬，膠原表達(dá)增加。
　　(4)急性百草枯中毒小鼠肺

16、組織中羥脯胺酸含量較對(duì)照組明顯增高。
　　(5)免疫組化顯示隨著中毒時(shí)間延長(zhǎng)急性百草枯中毒小鼠肺組織中TGF-β1表達(dá)增高，E-Cadherin表達(dá)下降，α-SMA表達(dá)增高。
　　[結(jié)論]
　　通過(guò)急性百草枯中毒患者雙肺CT變化及給予小鼠百草枯灌胃造模證實(shí)急性百草枯中毒肺纖維化模型成立。急性百草枯中毒后可引起血漿及肺組織中E-Cadherin表達(dá)下降，α-SMA表達(dá)增多，肺組織中羥脯胺酸含量增加進(jìn)一步證實(shí)肺纖維化診斷。