氨基胍對肺纖維化模型大鼠肺成纖維細胞影響的研究.pdf

1、本實驗目的是觀察AG對TGF-β1誘導體外肺纖維化模型大鼠肺成纖維細胞表達CTGF、α-SMA的影響，為AG治療肺纖維化機制的研究提供實驗資料。 研究方法： 1.動物處理：選用雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，一次性氣管內(nèi)滴注BLMA5(5mg/kg)復制大鼠肺纖維化模型，于給藥后第14天處死動物。 2.細胞培養(yǎng)：采用組織塊法培養(yǎng)大鼠肺成纖維細胞，培養(yǎng)條件：RPMI1640培養(yǎng)液(含10％小牛血清)1

2、0ml、5％CO2、37℃，第4代細胞用于實驗。 3.MTT法選擇TGF-β1和AG的適宜濃度：將細胞懸液(細胞濃度為2×105個/ml)滴注于96孔板中，培養(yǎng)24小時后，分別加入不同濃度的TGF-β1(1、10、20ng/ml)和AG(20、100、500μM)，刺激24小時后測定細胞MTT活力，根據(jù)以上結果及參考文獻選擇TGF-β1和AG的適宜濃度。 4.細胞分組：成纖維細胞分為4個組：①Sham組、②TGF-β1組

3、(濃度10ng/ml)、③AG+TGF-β1組(AG濃度500μM、TGF-β1濃度10ng/ml)、④AG組(濃度500μM)。 5.細胞免疫化學染色：將細胞懸液滴種于24孔板中，細胞濃度為2×105個/ml，每孔加液1ml，進行細胞爬片。加入各組藥物24小時后，用免疫細胞化學染色技術檢測CTGF、α-SMA陽性細胞。 6.流式細胞儀檢測肺纖維化模型大鼠肺成纖維細胞表達α-SMA。 7.統(tǒng)計學處理：實驗數(shù)據(jù)用均

4、數(shù)±標準差((-x)±SD)表示，采用SPSS-11.5統(tǒng)計軟件包，多個樣本均數(shù)比較用單因素方差分析(One-WayANOVA)，多個樣本均數(shù)間的兩兩比較用最小顯著差法(leastsignificantdifference，LSD)；以P＜0.05作為判斷差異顯著性的標準。 研究結果： 1.MTT法選擇藥物濃度。TGF-β1(1、10、20ng/ml)及AG(20μM、100μM、500μM)各藥物濃度組與不加藥組相比，

5、其差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，說明所選藥物濃度對肺纖維化模型大鼠肺成纖維細胞無藥物毒性。 2.肺成纖維細胞CTGF免疫細胞化學染色結果。TGF-β1誘導成纖維細胞表達CTGF的陽性細胞百分率(62.6±2.4％)、平均光密度值(平均OD值)(0.37±0.02)與Sham組(20.1±3.8％、0.29±0.02)比較，顯著性增加(P＜0.01)。AG+TGF-β1組與TGF-β1組相比，CTGF陽性細胞百分率(57.4

6、±3.8％)、平均OD值(0.35±0.02)均顯著性降低(P＜0.05)；而與Sham組相比，仍然較高(P＜0.01)。AG組CTGF陽性細胞百分率(21.3±3.2％)、平均OD值(0.30±0.02)與Sham組相比，均無顯著性差異(P＞0.05)。 3.肺成纖維細胞α-SMA免疫細胞化學染色結果。TGF-β1誘導成纖維細胞表達α-SMA的陽性細胞百分率(63.1±3.6％)、平均OD值(0.38±0.02)與Sham組(

7、21.3±4.3％、0.30±0.01)比較，顯著性增加(P＜0.01)。AG+TGF-β1組與TGF-β1組相比，α-SMA陽性細胞百分率(58.3±4.5％)、平均OD值(0.35±0.01)均顯著性降低(P＜0.05)；而與Sham組相比，仍然較高(P＜0.01)。AG組α-SMA陽性細胞百分率(22.7±4.5％)、平均OD值(0.30±0.01)與Sham組相比，均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。以上免疫細胞化學結果綜合分析：A

8、G單獨作用不影響成纖維細胞表達CTGF、α-SMA，但是AG能夠減弱TGF-β1誘導肺纖維化模型大鼠肺成纖維細胞表達CTGF、α-SMA的作用。 4.流式細胞儀檢測肺成纖維細胞表達α-SMA(以均道值表示)。Sham組均道值為516±5.6，TGF-β1組均道值(580±13.0)明顯高于Sham組(P＜0.01)。AG+TGF-β1組均道值(544±10.6)與Sham組相比，呈顯著性增加(P＜0.05)；與TGF-β1組相比