基于“疏通肺絡(luò)法”研究艾灸對肺纖維化大鼠上皮細胞-間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)分化機制的影響.pdf

1、研究目的：
　　肺纖維化（pulmonary fibrosis,PF)是呼吸系統(tǒng)最嚴重的疾病之一,臨床上主要表現(xiàn)為進行性呼吸困難、喘息、氣短、咳嗽咯痰,以限制性通氣功能障礙,低氧血癥為主,最終導(dǎo)致呼吸衰竭。上皮細胞-間質(zhì)細胞（epithelial-mesenchymal transition,EMT）理論是近年國際研究器官纖維化的主要成果之一。因此本課題擬在前期研究成果的基礎(chǔ)之上,采用疏通肺絡(luò)治法,選?。ǚ斡帷⒏嚯劣幔┌模╩ox

2、ibustion）,觀察由博來霉素復(fù)制的經(jīng)典肺纖維化大鼠模型在艾灸治療療程中上皮細胞蛋白E-鈣黏蛋白（E-cadherin,E-cad）,間質(zhì)細胞蛋白α-平滑肌蛋白（α-smooth muscle actin,α-SMA）、波形蛋白（vimentin）的mRNA表達的動態(tài)改變,初步闡明疏通肺絡(luò)法調(diào)控肺纖維化EMT關(guān)鍵位點與調(diào)控規(guī)律。
　　方法：
　　8周齡健康SPF級大鼠81只,體重180士20g,雌雄各半。將大鼠隨機分組：

3、空白對照（C）組9只；模型（B）組：模型7天（B7）組9只、模型11天（B11）組9只、模型23天（B23）組9只、模型35天（B35)組9只；艾灸（M）組：艾灸11天(M11）組9只、艾灸23天（M23）組9只、艾灸35天（M35）組9只；陽性對照（潑尼松,P）組9只。造模采用Thrall等方法氣管內(nèi)一次性注入博來霉素復(fù)制肺纖維化模型,空白對照組同樣按造模方法予以氣管內(nèi)一次性注射等體積的生理鹽水。各組造模均于第二天開始治療及干預(yù),艾灸

4、組交替艾灸雙側(cè)肺俞、膏育俞；潑尼松組以潑尼松灌胃；空白組和所有模型組與艾灸組采取同樣的抓取固定,不給予任何治療。模型組第7、11、23、35天,分別選對應(yīng)時間點組大鼠；艾灸組第11、23、35天（每療程后一天）,分別選取對應(yīng)時間點大鼠；潑尼松組、空白組于35天后全部選取。各組稱取體重,采取股動脈放血處死大鼠,打開胸腔,觀察肺大體顏色、體積、有無出血點、結(jié)節(jié)等。取左肺組于10％中性甲醛固定,再選取左肺上葉固定、包埋、切片行HE、Masso

5、n染色后,按照Szapie法進行肺泡炎分級評分和肺纖維化分級評分。取右肺上葉組織用于進行實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（QPCR）檢測E-cadherin mRNA、α-SMA mRNA、vimentin mRNA的表達。實驗過程中所得數(shù)據(jù)均采用SPSS19.0進行統(tǒng)計學分析,所有計量數(shù)據(jù)都用均數(shù)土標準差來表示,采用多因素方差分析進行統(tǒng)計學分析,P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)果：
　　1.各組大鼠一般情況觀察：

6、>　　空白對照組大鼠呼吸均勻平穩(wěn),毛發(fā)潤澤光亮,反應(yīng)靈敏,大便成形,體重正常增長；模型組大鼠呼吸急促,胸廓起伏增大加快,鼻部及爪甲呈青紫色,精神萎靡不振,弓背蜷縮,毛發(fā)稀疏無光澤,大便糖稀,體重明顯下降；治療后,艾灸組與模型組相比一般情況有較大的改善；陽性對照組同艾灸組無明顯差異。
　　2.肺系數(shù)
　　模型組、艾灸組和陽性對照組各組肺系數(shù)均顯著大于空白對照組(P<0.01)；模型組11d與艾灸組11d無統(tǒng)計學差異（P>0.0

7、5）,模型組23d肺系數(shù)較艾灸組23d、模型組35d肺系數(shù)較艾灸組35d均升高,有顯著性差異（P＜0.01）；模型組35d肺系數(shù)較陽性對照組高,有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）；艾灸35d組與陽性對照組肺系數(shù)無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。
　　3.病理學觀察
　　3.1模型組：模型組第7、11d肺泡炎程度較空白對照組均顯著升高（P<0.01）,模型組7d肺纖維化程度與空白對照組無明顯區(qū)別,統(tǒng)計學無差異（P>0.05）,模型組11

8、d肺纖維化明顯較空白對照組嚴重（P<0.01）；模型組第23、35d肺泡炎程度減輕但較空白對照組仍嚴重（P<0.05）,模型組23、35d肺纖維化程度較空白對照組嚴重,有顯著性差異（P<0.01）。
　　3.2艾灸組：艾灸組11d肺泡炎程度較空白對照組嚴重（P<0.01）,艾灸組23、35d肺泡炎程度有所減輕,較空白對照組仍有差異（P<0.05）；艾灸組11d較模型組11d肺泡炎癥有所減輕,有統(tǒng)計學差異（P<0.05）,模型組23

9、與艾灸組23d無明顯差異（P＞0.05）,艾灸35d較模型35d肺泡炎明顯減輕有顯著性差異（P<0.01）；艾灸組11、23、35d肺纖維化程度較空白對照組嚴重（P<0.01）,艾灸組11、23d分別與模型組11、23d無明顯差異（P>0.05）,艾灸組35d較模型35d肺纖維化程度減輕,有顯著性差異（P<0.01）。
　　3.3陽性對照組：陽性對照組肺泡炎程度和肺纖維化較空白對照組嚴重,有顯著性差異（P<0.01）,陽性對照組肺

10、泡炎癥程度與模型組35d、艾灸組35d均無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）；陽性對照組纖維化程度較模型組35d有所減輕,有統(tǒng)計學差異（P<0.05）,陽性對照組和艾灸組35d纖維化程度無明顯差異,無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。
　　4.各組肺組織蛋白mRNA的表達
　　4.1E-鈣黏蛋白mRNA表達的影響
　　與空白對照組相比,模型組、艾灸組、陽性對照組E-cad的mRNA表達量均有不同程度的下降,以模型組35d最低；艾灸治

11、療干預(yù)后艾灸組E-cad的mRNA表達量其下降趨勢明顯比同期模型組緩慢,尤其是第35d與模型組同期相比,艾灸組35dE-cad mRNA表達量明顯增多,有顯著差異(P<0.01)；而陽性對照組與模型組35d相比,陽性對照組E-cad mRNA表達量增多,有統(tǒng)計學差異(P<0.05)；
　　4.2α-平滑肌蛋白mRNA表達的影響
　　與空白對照組相比,模型組、艾灸組、陽性對照組a-SMA的m RNA表達量均有不同程度的上升,以

12、模型組35d最高；艾灸治療干預(yù)后艾灸組a-SMA的mRNA表達量其上升勢明顯比同期模型組緩慢,第11天與模型組相比,艾灸組11dα-SAM mRNA表達量明顯減少,有顯著差異(P<0.01)；第35天與模型組相比,艾灸組35dα-SAM mRNA表達量有所減少,有差異(P<0.05)。陽性對照組和模型組35d、艾灸組35d均無明顯差異,統(tǒng)計學無意義(P>0.05)。
　　4.3波形蛋白mRNA表達的影響
　　與空白對照組相比

13、,模型組、艾灸組、陽性對照組vimentin的mRNA表達量均有不同程度的上升,以模型組35d最高；艾灸治療干預(yù)后艾灸組vimentin的mRNA表達量其上升勢明顯比同期模型組緩慢,第23天與模型組相比,艾灸組23d vimentin mRNA表達量明顯減少,有顯著差異(P<0.01)；第35天與模型組相比,艾灸組35d vimentin mRNA表達量有所減少,有差異(P<0.01)；陽性對照組和模型組35d、艾灸組35d均無明顯差異

14、,統(tǒng)計學無意義(P>0.05)。
　　結(jié)論：
　　(1)本實驗通過一次性氣管灌注博萊霉素所獲得大鼠肺纖維化模型,其各時間點的病理形態(tài)改變與國內(nèi)外文獻報道基本一致,說明本實驗由博來霉素復(fù)制的經(jīng)典肺纖維化大鼠模型是成功的。
　　(2)艾灸對肺纖維化發(fā)展各個階段肺組織病理形態(tài)（肺泡炎和肺纖維化）有改善作用,說明艾灸對肺纖維化有一定的防治作用,其療效與艾灸療程的長短有關(guān),療程越長其治療效果越佳。
　　(3)艾灸對肺纖維化