重組腺病毒介導(dǎo)脂聯(lián)素基因?qū)poE---小鼠動(dòng)脈粥樣硬化和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷的作用和機(jī)制研究.pdf

1、目的：研究腺病毒介導(dǎo)的脂聯(lián)素（APN）過(guò)表達(dá)對(duì)（1）ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化（AS）的抑制作用和對(duì)NF-κB信號(hào)通路及其下游因子表達(dá)的影響；（2）對(duì)氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）AS樣損傷、NF-κB p65核蛋白及其信號(hào)通路下游炎癥因子的負(fù)性調(diào)控作用。
　　方法：⑴腺病毒介導(dǎo)的APN過(guò)表達(dá)對(duì)ApoE-/-小鼠動(dòng)物的安全性檢測(cè)：將48只常規(guī)飲食飼養(yǎng)的12周齡雄性ApoE-/-小鼠分為對(duì)

2、照組和脂聯(lián)素干預(yù)組，每組24只。對(duì)照組給予一次性尾靜脈注射生理鹽水100μl；干預(yù)組則同法注射等量腺病毒脂聯(lián)素載體（Ad-APN-eGFP，3.0×108 p.f.u）。分別在注射后0天、1周、2周、及4周處死小鼠，取全血和主動(dòng)脈血管組織。用ELISA測(cè)定血清中APN濃度；用Western blot法檢測(cè)血管組織中標(biāo)識(shí)綠色熒光蛋白（GFP）以確定重組腺病毒的轉(zhuǎn)染率。用全自動(dòng)生化儀檢測(cè)血常規(guī)指標(biāo)、心肌酶、尿素氮（BUN）以確定重組腺病毒轉(zhuǎn)

3、染的安全性。⑵腺病毒介導(dǎo)的APN過(guò)表達(dá)對(duì)ApoE-/-小鼠AS的抑制作用：將12周齡雄性ApoE-/-小鼠120只分為空載腺病毒對(duì)照組和脂聯(lián)素干預(yù)組，每組60只。兩組小鼠均給于高脂飲食誘發(fā)AS。分別在高脂飲食開始后0天、2周、4周、及6周時(shí)給予一次尾靜脈注射100μl腺病毒空載載體（Ad-eGFP,3.0×108 p.f.u）或腺病毒脂聯(lián)素載體（Ad-APN-eGFP，3.0×108 p.f.u）。在3個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)（0天、4周、8周）處

4、死受試小鼠，取全血和主動(dòng)脈血管組織。用全自動(dòng)生化儀檢測(cè)血脂指標(biāo)總膽固醇(TC)、甘油三脂(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)的濃度；ELISA法測(cè)定血清APN和基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）濃度；比色法測(cè)定超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）濃度。用油紅O染色法檢測(cè)動(dòng)脈血管總體的斑塊損傷百分比；HE染色法檢測(cè)小鼠主動(dòng)脈血管組織的病理學(xué)變化；Masson染色法檢測(cè)進(jìn)展性斑塊區(qū)的膠原含量和纖維

5、帽厚度變化；免疫組化法檢測(cè)血管巨噬細(xì)胞（MAC）和平滑肌細(xì)胞（SMC）的比例變化；實(shí)時(shí)熒光定量法測(cè)定小鼠主動(dòng)脈組織APN、一氧化氮合酶（eNOS）、白介素-10（IL-10）、IL-6、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、血管細(xì)胞粘附分子-1（VCAM-1）的mRNA表達(dá)；免疫熒光法測(cè)定小鼠主動(dòng)脈血管APN和 NF-κB p65蛋白的表達(dá)；免疫印跡法檢測(cè)主動(dòng)脈血管 NF-κB p65核蛋白和NF-κB下游因子的表達(dá)。⑶腺病毒介導(dǎo)的APN過(guò)表

6、達(dá)對(duì)用氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)誘導(dǎo)的體外培養(yǎng)的HUVEC AS樣損傷的干預(yù)。實(shí)驗(yàn)分四組：正常對(duì)照組（細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)，未用ox-LDL誘導(dǎo)）；ox-LDL誘導(dǎo)組（用30μg/ml的ox-LDL誘導(dǎo)細(xì)胞48h）；PDTC干預(yù)+ ox-LDL誘導(dǎo)組（先用100μmol/l的PDTC處理細(xì)胞1h，再用ox-LDL30μg/ml誘導(dǎo)48h）；Ad-APN-eGFP干預(yù)+ ox-LDL誘導(dǎo)組（以MOI=100 p.f.u/cell轉(zhuǎn)染HUV

7、EC細(xì)胞2h后，用ox-LDL30μg/ml誘導(dǎo)48h）。收集各組細(xì)胞用CCK-8比色法分析Ad-APN-eGFP轉(zhuǎn)染對(duì)HUVEC增殖活性的影響；流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡；ELISA法檢測(cè)HUVEC培養(yǎng)上清液中炎癥因子ICAM-1、VCAM-1、MCP-1及抗炎因子eNOS的表達(dá)；實(shí)時(shí)熒光定量法測(cè)定HUVEC中eNOS、ICAM-1、VCAM-1、MCP-1的mRNA表達(dá)；Western blot法檢測(cè)eNOS、ICAM-1、VCAM-1

8、、MCP-1、APN和NF-κB p65核蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果：①腺病毒對(duì)血常規(guī)指標(biāo)和心肌酶的表達(dá)沒(méi)有顯著影響，對(duì)肝功能指標(biāo)谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）(1周時(shí)組間差異P<0.01和2周時(shí)組間差異P<0.05)、腎功能指標(biāo)尿素氮BUN（1周時(shí)組間差異P<0.01)有一過(guò)性影響。rAd-APN-eGFP載體可在體內(nèi)高效介導(dǎo)外源基因APN的表達(dá)，血清中的APN濃度在病毒轉(zhuǎn)染后1周達(dá)到了最高值，約是正常對(duì)照組的4倍（78.28±15.02 v

9、s23.42±5.35）μg/ml，2周內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)。1周時(shí)GFP蛋白在血管組織中表達(dá)的量最高，1周時(shí)GFP/GAPDH為83.63±1.50％，隨后逐漸降低，2周時(shí)GFP/GAPDH為54.00±4.00%，4周時(shí)GFP/GAPDH為22.00±3.99%。②APN過(guò)表達(dá)抑制了 ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成。與對(duì)照組相比，脂聯(lián)素干預(yù)組的動(dòng)脈粥樣硬化病理?yè)p傷面積明顯減少（P<0.01），斑塊損傷面積4周時(shí)為1.35±0.17 v

10、s1.50±0.74(×104μm2)，8周時(shí)為1.70±0.34 vs2.21±0.28(×104μm2)；斑塊所占管腔比率顯著下降（P<0.001），4周時(shí)為28.36±3.22 vs35.61±7.43(%)，8周時(shí)為38.25±6.30 vs56.89±6.21(%)；動(dòng)脈粥樣硬化損傷程度明顯降低（P<0.001），總體油紅O染色測(cè)定血管表面損傷百分比，4周時(shí)為27.78±8.64 vs33.02±5.18(%)；8周時(shí)為31.

11、58±5.87 vs52.16±5.79(%)。脂聯(lián)素減緩了高脂飲食導(dǎo)致的小鼠血清中 TC（P<0.001）、TG（P<0.001）、LDL-C（P<0.001）的濃度增加，使血脂水平趨向正?；?，減緩了小鼠的體重增長(zhǎng)（P<0.05）。隨著血清脂聯(lián)素濃度增加，ApoE-/-小鼠整體的炎性狀態(tài)減輕，MMP-9的水平顯著降低（P<0.05），4周時(shí)為50.23±14.24 vs51.33±15.66(ng/ml)，8周時(shí)為55.99±11.7

12、4 vs80.50±14.54(ng/ml)；SOD活性顯著增加（P<0.05），MDA水平顯著降低（P<0.001），氧化應(yīng)激程度降低。外源性的脂聯(lián)素上調(diào)抗炎因子 eNOS（P<0.05）和 IL-10（P<0.001）的mRNA基因表達(dá)，降低炎性因子TNF-α（P<0.001）、IL-6（P<0.001）、VCAM-1（P<0.05）的基因表達(dá)。脂聯(lián)素可以阻遏 NF-κB通路的激活，抑制 NF-κB p65核蛋白表達(dá)（P<0.001

13、）。③rAd-APN-eGFP可以高效、穩(wěn)定地轉(zhuǎn)染人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，rAd-APN-eGFP對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率在轉(zhuǎn)染復(fù)數(shù) MOI=100 p.f.u/cell，轉(zhuǎn)染48h時(shí)達(dá)到高峰85.03±6.77%，至轉(zhuǎn)染后72h，eGFP在HUVEC細(xì)胞仍處于高表達(dá)84.26±7.16%。ox-LDL誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞造成內(nèi)皮細(xì)胞體外損傷模型，激活NF-κB信號(hào)通路， NF-κB p65核蛋白的表達(dá)量顯著增加（P<0.001）。rAd

14、-APN-eGFP轉(zhuǎn)染能夠抑制NF-κB通路的激活，使NF-κB p65核蛋白表達(dá)量顯著降低（P<0.001）。降低NF-κB調(diào)節(jié)的下游炎癥分子VCAM-1、ICAM-1、MCP-1的基因和蛋白表達(dá)（P<0.001），增加抗炎因子eNOS的基因和蛋白表達(dá)（P<0.001）。Ad-APN-eGFP和NF-κB抑制劑PDTC干預(yù)抑制內(nèi)皮細(xì)胞損傷的作用基本一致，沒(méi)有顯著差異（P>0.05）。
　　結(jié)論：⑴腺病毒注射存在一過(guò)性的肝毒性和腎

15、毒性，但是對(duì)動(dòng)物的生理狀態(tài)沒(méi)有顯著影響。rAd-APN-eGFP對(duì)ApoE-/-小鼠的血管組織有高效轉(zhuǎn)染、2周內(nèi)安全、穩(wěn)定表達(dá)的特性。⑵脂聯(lián)素過(guò)表達(dá)對(duì) ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化具有顯著的保護(hù)作用，減輕模型整體的炎性水平。抑制NF-κB通路的激活，NF-κB p65核蛋白表達(dá)和NF-κB下游炎癥因子的表達(dá)，上調(diào)抗炎因子的表達(dá)，說(shuō)明脂聯(lián)素通過(guò)抑制NF-κB通路激活來(lái)減輕AS這種炎癥反應(yīng)；⑶rAd-APN-eGFP載體可高效、穩(wěn)定地轉(zhuǎn)染