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1、目的:持續(xù)的病毒復(fù)制和免疫應(yīng)答是乙肝治療的難題,而HMGB1分子是近年在感染性疾病的研究中逐漸被重視的細(xì)胞因子,已有的研究發(fā)現(xiàn)HMGB1與多種病毒性疾病的發(fā)病機(jī)制有關(guān)。本研究擬通過(guò)檢測(cè)臨床各型乙肝患者外周血HMGB1、sRAGE、IL-6含量,肝組織HMGB1、RAGE的表達(dá)與分布,并與乙肝臨床指標(biāo)進(jìn)行分析,以探討HMGB1對(duì)乙肝病毒復(fù)制和病理性肝損傷的可能作用,為乙肝的發(fā)病機(jī)制提供理論依據(jù)。
方法:①臨床收集各型乙型病毒
2、性肝炎的外周血,運(yùn)用ELISA和實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)HMGB1、sRAGE、IL-6及HMGB1 mRNA的表達(dá),并與臨床指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析。②采集乙型病毒性肝炎患者肝組織,實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)HMGB1 mRNA的表達(dá)量,Western blot、免疫熒光組織化學(xué)觀察HMGB1、RAGE在肝組織細(xì)胞漿、細(xì)胞核的表達(dá)水平及分布情況,并與臨床指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析。
結(jié)果:⑴乙肝患者外周血實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示,AsC、
3、CHB-1、CHB-2、CHB-3、SH組的2-△△CT>2,HMGB1 mRNA表達(dá)水平呈逐漸上升的趨勢(shì),這四組與control組比較,有顯著性差異;LC-1、LC-2組的2-△△CT>2,HMGB1 mRNA表達(dá)水平呈逐漸上升的趨勢(shì),這兩組與control組比較,有顯著性差異。⑵乙肝患者外周血清HMGB1 ELISA結(jié)果顯示,AsC、CHB-1、CHB-2、CHB-3、SH組,血清HMGB1的濃度逐漸升高;AsC組與control組
4、比較,無(wú)顯著性差異(P>0.05):CHB-1組與control組比較,有顯著性差異(P<0.05);CHB-2、CHB-3、SH組與control組比較,有顯著性差異(p<0.01);LC-1、LC-2組與control組比較,血清HMGB1的濃度逐漸升高,有顯著性差異(p<0.01)。⑶乙肝患者外周血清sRAGE ELISA結(jié)果顯示,AsC、CHB-1、CHB-2組,血清sRAGE的濃度逐漸減少,與control組比較,具有顯著性差
5、異(p<0.01);CHB-3、SH組,血清sRAGE的濃度逐漸增多,與control組比較具有顯著性差異(p<0.01);LC-1、LC-2組,血清sRAGE的濃度逐漸升高,與control組比較具有顯著性差異(p<0.01)。⑷乙肝患者外周血清IL-6 ELISA結(jié)果顯示,AsC、CHB-1、CHB-2、CHB-3、SH組與control組比較,血清IL-6的濃度逐漸升高;在AsC組與control組比較,表達(dá)無(wú)顯著性差異(P>0.
6、05);CHB-l組與control組比較,表達(dá)有顯著性差異(P<0.05);LC-1、LC-2組與control組比較,血清IL-6的濃度逐漸升高,表達(dá)有顯著性差異(P<0.01)。⑸各指標(biāo)Spearman秩相關(guān)分析顯示:control、AsC、CHB-1、CHB-2、CHB-3、SH、LC-1、LC-2組中外周血HMGB1與TBIL、IL-6、HBV-DNA均成正相關(guān)(r分別為0.495、0.886、0.511,P<0.01);與P
7、TA、A、CHE均成負(fù)相關(guān)(r分別為.0.849、-0.848、-0.727,P<0.01)。control、AsC、CHB-1、CHB-2組中外周血HMGB1與sRAGE成負(fù)相關(guān)(r為-0.873,P<0.01);CHB-3、SH、LC-1、LC-2中外周血HMGB1與sRAGE成正相關(guān)(r為0.832,P<0.01)。⑹乙肝患者肝組織實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示,AsC、CHB-1、CHB-2、LC-1組的2-△△CT>2,表示這四組較c
8、ontrol組HMGB1 mRNA表達(dá)水平有顯著性差異,其中AsC、CHB-1、CHB-2組較control組,HMGB1mRNA表達(dá)水平呈逐漸上升的趨勢(shì)。⑺乙肝患者肝組織總蛋白Western blot結(jié)果顯示,在AsC、CHB-1、CHB-2、LC-1組較control組中HMGB1蛋白表達(dá)具有顯著性差異(P<0.01),其中,AsC、CHB-1、CHB-2比control組HMGB1蛋白表達(dá)水平逐漸升高。AsC、CHB-1、CHB-
9、2、LC-1組較control組RAGE蛋白表達(dá)水平逐漸升高,差異具有顯著性(P<0.01)。⑻乙肝患者肝組織細(xì)胞胞漿蛋白Western blot結(jié)果顯示,在AsC、CHB-1、CHB-2、LC-1組較control組中HMGB1蛋白表達(dá)具有顯著性差異(P<0.01),其中,AsC、CHB-1、CHB-2比control組HMGB1蛋白表達(dá)水平逐漸升高。AsC、CHB-1、CHB-2、LC-1組較control組RAGE蛋白表達(dá)水平逐漸
10、升高,具有顯著性差異(P<0.01)。⑼乙肝患者肝組織細(xì)胞胞核蛋白Western blot結(jié)果顯示,在AsC組較control組HMGB1蛋白表達(dá)水平增多,具有顯著性差異(P<0.05);CHB-1、CHB-2組均較control組HMGB1蛋白表達(dá)水平增多,具有顯著性差異(P<0.01);LC-1組較control組HMGB1蛋白表達(dá)水平增多,但無(wú)顯著性差異(P>0.05)。⑽乙肝患者肝組織總蛋白HMGB1與臨床各指標(biāo)Spearman
11、秩相關(guān)分析顯示:control、AsC、CHB-1、CHB-2、LC-1組中HMGB1與TBIL成正相關(guān)(r為0.725,P<0.01);與PTA、A、CHE均成負(fù)相關(guān)(r分別為-0.736、-0.684、-0.861,P<0.01);與HBV-DNA無(wú)相關(guān)(r為0.008,P>0.05)。⑾乙肝患者肝組織免疫熒光組織化學(xué)觀察結(jié)果表示,各組肝組織肝細(xì)胞漿、肝細(xì)胞核都有HMGB1分布,以在肝細(xì)胞漿表達(dá)為主,control、AsC、CHB-
12、1、CHB-2組的肝細(xì)胞漿、肝細(xì)胞核HMGB1表達(dá)逐漸增多,以肝細(xì)胞漿HMGB1增多較為明顯;LC-1組肝組織肝細(xì)胞細(xì)胞漿、細(xì)胞核的HMGB1表達(dá)較control組增多,以肝細(xì)胞漿HMGB1增多較為明顯。⑿乙肝患者肝組織免疫熒光組織化學(xué)觀察結(jié)果表示,在各組肝組織肝細(xì)胞核內(nèi)幾乎無(wú)RAGE分布,RAGE主要表達(dá)在肝細(xì)胞漿與細(xì)胞膜上。RAGE在Contro1、AsC、CHB-1、CHB-2、LC-1組的表達(dá)逐漸增多。
結(jié)論:①乙
13、肝患者外周血的HMGB1 mRNA和HMGB1蛋白的表達(dá)明顯高于正常對(duì)照組,且與疾病的嚴(yán)重程度有關(guān),病情越嚴(yán)重,HMGB1的表達(dá)越多,說(shuō)明HMGB1可能影響乙肝的病理性變化。②HMGB1的濃度和組織的炎癥及纖維化程度對(duì)sRAGE的表達(dá)有影響,說(shuō)明HMGB1可能協(xié)同sRAGE影響乙肝炎癥反應(yīng)、乙肝后肝硬化的病理過(guò)程。③HMGB1與臨床指標(biāo)TBIL成正相關(guān);與CHE、A、PTA均成負(fù)相關(guān);說(shuō)明HMGB1影響肝臟的新陳代謝功能,即表明HMGB
14、1可能會(huì)成為判斷肝功能的一個(gè)新指標(biāo)。④乙肝患者肝組織的HMGB1 mRNA表達(dá)水平隨著疾病的嚴(yán)重程度變化,進(jìn)一步說(shuō)明了HMGB1與乙肝疾病的病情變化相關(guān)。⑤乙肝患者外周血HMGB1與HBV-DNA呈正相關(guān),但是肝組織總蛋白的HMGB1與HBV-DNA無(wú)相關(guān)性,由于HMGB1在肝細(xì)胞的胞核和胞漿中功能狀態(tài)未知,仍不能排出HMGB1與HBV復(fù)制的相關(guān)性,需進(jìn)一步的研究以論證。⑥HMGB1在肝組織的細(xì)胞核、細(xì)胞漿的表達(dá)隨著疾病的類(lèi)型不同有差異
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