自聚肽納米纖維對(duì)骨髓源性心肌干細(xì)胞存活、分化和修復(fù)壞死心肌的作用.pdf

1、目的：探討二氮嗪(DZ)對(duì)骨髓源性心肌干細(xì)胞(MCSCs)抗氧化應(yīng)激的作用及其機(jī)制,明確自聚肽納米纖維對(duì)MCSCs增殖、存活及向心肌細(xì)胞分化的作用,為將新型納米材料自聚肽應(yīng)用于臨床干細(xì)胞移植治療心肌梗死等缺血性心臟病提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法通過單細(xì)胞克隆培養(yǎng)技術(shù)、c-kit免疫熒光標(biāo)記和RT-PCR檢測(cè)心肌早期轉(zhuǎn)錄因子Nkx2.5的表達(dá),從骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中篩選具有心肌特異分化潛能的MCSCs。利用H2O2處理MCSCs造成氧化應(yīng)激損傷

2、,AnncxinV/PI雙標(biāo)記和乳酸脫氫酶(LDH)泄漏實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞凋亡和膜完整性以及DZ的保護(hù)作用。采用免疫染色法進(jìn)行細(xì)胞色素C的定位,RT-PCR.和Western blot檢測(cè)DZ對(duì)細(xì)胞HGF、bFGF及VEGF的基因表達(dá)和Akt磷酸化水平變化,探討DZ對(duì)細(xì)胞保護(hù)作用的機(jī)制。固相合成新型納米材料自聚肽,掃描電鏡和原子力顯微鏡下觀察自組裝后的形態(tài)結(jié)構(gòu)。將細(xì)胞懸液與等體積1％自聚肽溶液混合后培養(yǎng)1d時(shí),在掃描電鏡和透射電鏡下觀察自聚肽

3、納米纖維與細(xì)胞的相互關(guān)系。通過CCK-8法和AO/EB染色法檢測(cè)自聚肽納米纖維對(duì)MCSCs增殖和存活的作用。將MCSCs在自聚肽納米纖維中培養(yǎng)4wk,用相差顯微鏡和掃描電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化,采用免疫熒光染色檢測(cè)cTnT的表達(dá),綜合評(píng)價(jià)自聚肽納米纖維對(duì)MCSCs向心肌細(xì)胞分化的作用。建立大鼠急性心肌梗死模型,30min后,將實(shí)驗(yàn)隨機(jī)分為5組,即對(duì)照組、MCSCs移植組、DZ預(yù)處理MCSCs移植組、自聚肽承載MCSCs移植組、自聚肽承載DZ

4、預(yù)處理MCSCs移植組。細(xì)胞移植后4wk,用M型超聲心動(dòng)圖檢測(cè)心功能恢復(fù)狀態(tài)。取各組心臟作組織切片,進(jìn)行Masson染色和免疫組織化學(xué)染色,利用圖像分析檢測(cè)瘢痕面積、膠原纖維比率和微血管密度。用原位熒光雜交法標(biāo)記心肌組織中Y染色體陽性移植細(xì)胞,并檢測(cè)其cTnT的表達(dá)。結(jié)果經(jīng)DZ預(yù)處理后,在氧化應(yīng)激條件下細(xì)胞凋亡率下降,LDH的泄漏減少,與未預(yù)處理組比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。氧化應(yīng)激損傷引起線粒體內(nèi)的細(xì)胞色素C滲漏到細(xì)胞質(zhì),經(jīng)DZ預(yù)處理后

5、,未觀察到明顯的細(xì)胞色素C滲漏現(xiàn)象。DZ預(yù)處理后細(xì)胞內(nèi)HGF和bFGFmRNA表達(dá)顯著上調(diào),同時(shí)磷酸化Akt表達(dá)上調(diào)。本實(shí)驗(yàn)合成的自聚肽純度為97.52％。掃描電鏡下可見,1％RAD16-Ⅱ多肽溶液在37℃條件下自組裝成納米纖維,并相互交織成網(wǎng)狀支架結(jié)構(gòu),該支架孔徑為50～200nm。原子力顯微鏡顯示,納米纖維直徑約10nm,長(zhǎng)度為100～300nm。體外實(shí)驗(yàn)研究顯示,用自聚肽承載MCSCs培養(yǎng)1d后,掃描電鏡下可見自聚肽自組裝成納米纖

6、維,在細(xì)胞之間形成網(wǎng)狀納米纖維支架。細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形,位于三維納米纖維支架的網(wǎng)孔中,生長(zhǎng)狀態(tài)良好。在透射電鏡觀察到,細(xì)胞與細(xì)胞之間有許多均勻分布的納米纖維片段,纖維與細(xì)胞緊密相接。用CCK-8檢測(cè)法繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線,細(xì)胞在自聚肽納米纖維支架中的增殖能力明顯高于對(duì)照組,差異有顯著性意義。在體外缺血缺氧條件下培養(yǎng)8h后,自聚肽納米纖維支架中的細(xì)胞凋亡率明顯低于對(duì)照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。MCSCs在自聚肽納米纖維中培養(yǎng)4wk時(shí),在相差顯微鏡下可

7、見自聚肽納米纖維組與對(duì)照組細(xì)胞相比,形態(tài)和排列方式均發(fā)生明顯改變。掃描電鏡顯示,呈平行排列柱狀細(xì)胞之間可見少量纖維碎片,大部分納米纖維已降解。免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色顯示,自聚肽納米纖維組細(xì)胞的cTnT表達(dá)明顯強(qiáng)于對(duì)照組。心肌梗死模型大鼠在細(xì)胞移植4wk檢測(cè)結(jié)果顯示,DZ預(yù)處理MCSCs移植組的大鼠心功能恢復(fù)、心肌瘢痕面積減小和Y染色體陽性細(xì)胞數(shù)都優(yōu)于MCSCs移植組,差異有顯著性意義。與預(yù)處理MCSCs移植組相比,自聚肽承載細(xì)胞移植組大鼠

8、的心功能指數(shù)明顯提高、瘢痕面積明顯減小、微血管密度明顯增加、Y染色體陽性細(xì)胞數(shù)明顯增多,差異均具有顯著性意義。自聚肽承載MCSCs移植組和自聚肽承載預(yù)處理MCSCs移植組大鼠的心功能指數(shù)、瘢痕面積、微血管密度和Y染色體陽性細(xì)胞數(shù)差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。自聚肽承載細(xì)胞移植組心肌內(nèi)的Y染色體陽性細(xì)胞主要分布于瘢痕區(qū)邊緣。免疫組織化學(xué)染色顯示,Y染色體陽性細(xì)胞表達(dá)cTnT,與周圍心肌細(xì)胞的cTnT表達(dá)強(qiáng)度相同。結(jié)論DZ預(yù)處理可以提高M(jìn)CSCs的抗

9、氧化應(yīng)激能力,其機(jī)制與減少細(xì)胞色素C從線粒體滲漏到細(xì)胞質(zhì)以及提高細(xì)胞的HGF和bFGF基因表達(dá)有關(guān)。自聚肽納米纖維有利于MCSCs的增殖、存活和向心肌細(xì)胞分化,可以作為一種可注射的心肌組織工程材料。自聚肽承載MCSCs移植治療心肌梗死,有利于移植細(xì)胞在受損心肌內(nèi)的存活和向功能性心肌分化,并促進(jìn)血管新生,其療效優(yōu)于DZ預(yù)處理干細(xì)胞移植。這為將新型納米材料自聚肽應(yīng)用于臨床干細(xì)胞移植治療心肌梗死等缺血性心臟病提供可行性的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)具有重要