經(jīng)冠脈自體骨髓單個(gè)核細(xì)胞移植修復(fù)梗死心肌的實(shí)驗(yàn)觀察.pdf

1、背景：心肌梗死（MI）是心肌的急性壞死，病情兇險(xiǎn)，病死率高。傳統(tǒng)觀念認(rèn)為，心肌細(xì)胞壞死后不能再生，成纖維細(xì)胞增生修復(fù)，形成瘢痕組織，并逐步發(fā)生心室重構(gòu)，發(fā)展為頑固性心力衰竭。目前的藥物治療、介入治療和冠脈旁路移植術(shù)能夠恢復(fù)一定的血供，但均不能充分補(bǔ)充有效工作的心肌，無(wú)法改善MI的遠(yuǎn)期預(yù)后。近年來(lái)，細(xì)胞移植治療心肌梗死為重建受損心肌帶來(lái)新的希望。雖然相關(guān)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)及臨床研究比較廣泛，但研究結(jié)果均不一致，存在爭(zhēng)議。細(xì)胞移植后的分化問(wèn)題、細(xì)胞移

2、植能否長(zhǎng)期持久地改善心臟功能、改善缺血心功能的機(jī)制以及細(xì)胞移植是否引起心律失常這些問(wèn)題均不明確。
　　 目的:1.結(jié)扎犬冠狀動(dòng)脈左前降支建立心肌梗死模型。2.觀察骨髓單個(gè)核細(xì)胞懸液（BM-MNCs）的制備及經(jīng)冠脈注射的可行性。3.觀察經(jīng)冠脈移植BM-MNCs對(duì)梗死后心功能的影響。4.觀察熒光染料CM-DiI標(biāo)記BM-MNCs的效率及熒光在體的時(shí)間。5.觀察標(biāo)記的BM-MNCs能否在梗死心肌內(nèi)存活并且分化成為心肌樣細(xì)胞。6.觀察B

3、M-MNCs移植對(duì)血管形成的影響及對(duì)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF）、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）mRNA表達(dá)的影響。7.觀察BM-MNCs移植后心肌的有效不應(yīng)期有無(wú)改變。8.觀察BM-MNCs移植有無(wú)導(dǎo)致惡性心律失常發(fā)生的潛在風(fēng)險(xiǎn)。9.觀察BM-MNCs移植后能否糾正縫隙連接排列紊亂而減少心律失常的發(fā)生。
　　 方法:1.雜種犬16只，隨機(jī)分為移植組（n=10）和對(duì)照組（n=6）兩組，結(jié)扎冠

4、狀動(dòng)脈前降支建立犬心肌梗死模型。2.移植組的實(shí)驗(yàn)犬全麻后無(wú)菌條件下于髂前/后上嵴抽取骨髓25-30ml，ficoll淋巴細(xì)胞分離液密度梯度離心法分離得BM-MNCs，CM-DiI標(biāo)記待移植的BM-MNCs，用倒置相差熒光顯微鏡觀察細(xì)胞數(shù)目和標(biāo)記效率，調(diào)整細(xì)胞濃度為3×107-1×108/ml。3.結(jié)扎冠脈后2h恢復(fù)血流，于冠脈結(jié)扎點(diǎn)遠(yuǎn)端插入套管針，向套管內(nèi)注射制備好的BM-MNCs，對(duì)照組移植等量生理鹽水，最后完全結(jié)扎LAD。術(shù)后予抗生

5、素3天，飼養(yǎng)觀察6周。4.所有實(shí)驗(yàn)犬于梗死后2h（細(xì)胞移植前）、移植后6周行血流動(dòng)力學(xué)檢查，測(cè)量左室收縮壓、左室舒張末壓；以熱稀釋法測(cè)量心排血量。5.所有實(shí)驗(yàn)犬于梗死后2h（細(xì)胞移植前）、移植后6周進(jìn)行超聲心動(dòng)圖檢查，測(cè)量左室舒張末內(nèi)徑、左室收縮末內(nèi)徑、左室舒張末容積、左室收縮末容積、射血分?jǐn)?shù)、短軸縮短率和每搏量。6.移植后6周，氯化鉀注射法處死犬，取梗死區(qū)、梗死周邊區(qū)心肌，觀察CM-DiI示蹤的細(xì)胞的分布，免疫熒光染色檢測(cè)CM-DiI

6、示蹤的細(xì)胞是否表達(dá)心肌細(xì)胞特異性蛋白-心肌β-肌球蛋白重鏈（cardiac myosin heavy chain，β-MHC）、連接蛋白43（Connexin43，Cx43）。vWF免疫組化染色，計(jì)算毛細(xì)血管密度。RT-PCR檢測(cè)VEGF、bFGF和MMP-9的mRNA表達(dá)。7.梗死后6周測(cè)定心臟不同部位的有效不應(yīng)期，免疫組化染色檢測(cè)Connexin43的表達(dá)。
　　 結(jié)果:1.BM-MNCs經(jīng)CM-DiI標(biāo)記后，細(xì)胞膜著色，紫

7、外光激發(fā)呈現(xiàn)紅色。標(biāo)記效率為95％-100％。2.細(xì)胞移植治療6周后，在BM-MNCs移植治療的犬心肌組織均可見(jiàn)到CM-DiI標(biāo)記的紅色細(xì)胞；細(xì)胞移植組的心肌MHC、Connexin43免疫熒光染色均為陽(yáng)性，呈現(xiàn)綠色熒光；與CM-DiI標(biāo)記的紅色熒光供體細(xì)胞進(jìn)行疊加，可見(jiàn)β-MHC、Connexin43染色雙陽(yáng)性的細(xì)胞，呈現(xiàn)黃色熒光。3.對(duì)照組心肌梗死后6周和心肌梗死后2h比較，各項(xiàng)血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)均無(wú)顯著改善（P>0.05）；而在移植組

8、，細(xì)胞移植后6周LVEDP較梗死后2h（細(xì)胞移植前）明顯降低，差異有顯著性（5.1±3.07 vs9.2±4.34，P<0.05）；與梗死后6周的對(duì)照組比較，LVEDP亦明顯降低，差異有顯著性（5.1±3.07 vs11.67±3.42，P<0.01）。移植組細(xì)胞移植后6周CO較心肌梗死后2h（細(xì)胞移植前）明顯升高，差異有顯著性（3.1±0.89 vs2.14±0.49，P<0.01）；與梗死后6周的對(duì)照組比較，CO亦明顯升高，差異有顯

9、著性（3.1±0.89 vs2.39a：0.43，P<0.05）。余指標(biāo)無(wú)顯著變化（P>0.05）。4.對(duì)照組心肌梗死后6周和心肌梗死后2h比較，各項(xiàng)超聲心動(dòng)指標(biāo)均無(wú)顯著改善（P>0.05）；移植組細(xì)胞移植后6周，ESD、ESV、EDV、LVEF、FS、SV均較移植前有明顯改善，與梗死后6周的對(duì)照組相比，亦有明顯改善（P<0.05），其中移植組EF較對(duì)照組提高7％左右，余指標(biāo)無(wú)顯著變化（P>0.05）。5.BM-MNCs移植后6周，移植

10、組有明顯的血管新生，梗死邊緣區(qū)新生血管數(shù)量，移植組明顯高于對(duì)照組（19.32±2.47 vs9.47±1.28，P<0.01），而兩組的梗死中心區(qū)的新生血管數(shù)量無(wú)顯著性差異（3.44±0.51 vs3.07±0.3，P>0.05）。6.移植組促血管生長(zhǎng)因子VEGF188的mRNA表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組（1.16±0.38 vs0.45±0.15，P<0.01）：移植組VEGF164的mRNA表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組（1.17±0.3 vs

11、0.42±0.17，P<0.01）；移植組促血管生長(zhǎng)因子bFGF的mRNA表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組（0.90±0.21 vs0.63+0.28，P<0.05）；移植組基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-9的mRNA表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組（0.59±0.18 vs0.93±0.3，P<0.05）。7.移植組與對(duì)照組相比，梗死6周測(cè)得梗死區(qū)、梗死周邊區(qū)和正常區(qū)有效不應(yīng)期無(wú)明顯差別（85±9.26 vs90±7.07ms，P>0.05）（87.78±9.37

12、 vs90±7.07，P>0.05）（85±11.95 vs88.33±9.4，P>0.05）；移植組和對(duì)照組正常心肌區(qū)之間Connexin43表達(dá)無(wú)顯著性差異（3543.7±446.00 vs3431.67+421.54，P>0.05）；移植組梗死邊緣區(qū)Cx43較對(duì)照組明顯增多（2312.50±412 vs1356.17±332.73，P<0.05），但仍明顯少于正常區(qū)相應(yīng)部位（2312.50±412 vs3543.7±446.00，

13、P<0.05）：在梗死中心區(qū)移植組和對(duì)照組比較差異無(wú)顯著性（327.00±98.67 vs311.33±78.74，P>0.05）。
　　 結(jié)論:1.熒光染料CM-DiI標(biāo)記BM-MNCs細(xì)胞效率高，熒光在活體細(xì)胞內(nèi)存在的時(shí)間大于6周，可成功示蹤移植的BM-MNCs。2.CM-DiI示蹤的細(xì)胞能在梗死心肌內(nèi)存活并且分化成為具有心肌細(xì)胞特異性標(biāo)記-β-MHC的心肌樣細(xì)胞，并同時(shí)表達(dá)Connexin43。3.經(jīng)冠脈內(nèi)注射移植自體BM