未培養(yǎng)的自體骨髓單個(gè)核細(xì)胞修復(fù)全層關(guān)節(jié)軟骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:長(zhǎng)期以來(lái),軟骨缺損一直是臨床所面臨的難題。傳統(tǒng)的治療方法,如磨削成型術(shù)、鉆孔微骨折、軟骨以及軟骨膜移植等,總體療效不佳。近年來(lái),組織工程學(xué)的蓬勃發(fā)展為軟骨損傷的修復(fù)開(kāi)辟了一條新的途徑。選擇理想的種子細(xì)胞對(duì)軟骨組織工程至關(guān)重要。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)具有取材方便、體外擴(kuò)增能力強(qiáng)、多分化潛能好等特點(diǎn),被認(rèn)為是最具前途的組織工程種子細(xì)胞。然而,MSCs的體外培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化還存在許多問(wèn)題

2、。例如,體外培養(yǎng)操作過(guò)程繁瑣,容易污染,且細(xì)胞離開(kāi)了體內(nèi)同細(xì)胞外基質(zhì)共同構(gòu)成的三維立體結(jié)構(gòu),生物學(xué)行為受到影響,容易變異。MSCs的定向分化機(jī)制、條件還不是很清楚,如何既控制增殖,又能在適當(dāng)?shù)臅r(shí)候調(diào)控MSCs定向分化,還有待進(jìn)一步研究。骨髓單個(gè)核細(xì)胞(bone-marrow-derived mononuclear cells,BM-MNCs)包括造血干細(xì)胞、MSCs、內(nèi)皮祖細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞等,是含有多種細(xì)胞成分的混合細(xì)胞群。研究表明,和骨

3、髓中某種純化的細(xì)胞相比,BM-MNCs可提供細(xì)胞之間相互依賴、分化的誘導(dǎo)微環(huán)境,分離后直接移植還可避免體外擴(kuò)增遷移帶來(lái)的多分化潛能和自動(dòng)遷移性的下降。因此應(yīng)用未培養(yǎng)的BM-MNCs作為種子細(xì)胞修復(fù)軟骨缺損,可避免MSCs培養(yǎng)及誘導(dǎo)過(guò)程中的諸多問(wèn)題,理論上具有明顯的優(yōu)越性。本實(shí)驗(yàn)旨在探討未培養(yǎng)的BM-MNCs修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損的可行性,評(píng)價(jià)其治療效果,為今后軟骨組織工程的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。
　　 方法:將36只實(shí)驗(yàn)兔隨機(jī)分為3組,每

4、組各12只。實(shí)驗(yàn)組均自左股骨遠(yuǎn)端髓腔抽取骨髓5ml,分離提取自體BM-MNCs。建立兔右膝軟骨缺損模型后,實(shí)驗(yàn)組植入未培養(yǎng)的自體骨髓單個(gè)核細(xì)胞-自體纖維蛋白凝膠復(fù)合體;實(shí)驗(yàn)對(duì)照組植入自體纖維蛋白凝膠;空白對(duì)照組不行任何植入。分別于術(shù)后第8周、12周用空氣栓塞法處死動(dòng)物,每次每組各處死6只,用擺鋸鋸取右側(cè)股骨滑車(chē)部,包括軟骨及軟骨下的骨組織。對(duì)標(biāo)本進(jìn)行大體觀察、光鏡觀察包括HE染色和甲苯胺藍(lán)染色、采用SABC法行Ⅱ型膠原的免疫檢測(cè),評(píng)價(jià)修

5、復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損的效果。
　　 結(jié)果:
　　 1大體觀察:術(shù)后8周,實(shí)驗(yàn)組缺損區(qū)由乳白色修復(fù)組織填充,邊界模糊,表面較光滑。實(shí)驗(yàn)對(duì)照組修復(fù)組織色澤淺黃,表面不光整,與周?chē)＼浌墙M織間界限清晰。空白對(duì)照組缺損區(qū)為纖維組織部分填充,仍有較大的空洞。術(shù)后12周實(shí)驗(yàn)組修復(fù)組織表面光滑,與周?chē)浌巧珴上嘟?間界限模糊不清。實(shí)驗(yàn)對(duì)照組修復(fù)組織表面粗糙,明顯凹陷?？瞻讓?duì)照組由乳白色修復(fù)組織部分填充,仍有明顯缺損。
　　 2組織

6、學(xué)觀察:術(shù)后8周,實(shí)驗(yàn)組標(biāo)本光鏡下可見(jiàn)修復(fù)組織表面比較光滑,移植區(qū)周?chē)叭睋p底部軟骨組織開(kāi)始骨化。修復(fù)組織表層細(xì)胞形態(tài)扁平,向下逐漸移行成為圓形、橢圓形,體積漸增大,出現(xiàn)軟骨囊和軟骨陷窩。但是與正常軟骨相比,修復(fù)組織內(nèi)細(xì)胞數(shù)目多、細(xì)胞形態(tài)小、細(xì)胞排列紊亂。修復(fù)組織厚度大于正常軟骨厚度。修復(fù)組織甲苯胺藍(lán)異染性明顯。實(shí)驗(yàn)對(duì)照組標(biāo)本缺損區(qū)可見(jiàn)少量纖維組織和大量空泡,修復(fù)組織與周?chē)M織的愈合差,缺損區(qū)周?chē)浌怯型诵行宰儽憩F(xiàn),甲苯胺藍(lán)染色無(wú)異染性

7、?？瞻讓?duì)照組標(biāo)本缺損區(qū)由薄層纖維組織覆蓋,修復(fù)組織與周?chē)M織的接合較好,甲苯胺藍(lán)染色無(wú)異染性。術(shù)后12周,實(shí)驗(yàn)組標(biāo)本修復(fù)組織為透明樣軟骨,細(xì)胞數(shù)目有所減少,呈現(xiàn)柱狀排列趨勢(shì),修復(fù)組織表面光滑,與周?chē)＼浌墙M織結(jié)合良好,深層軟骨逐漸鈣化,與周?chē)能浌窍鹿墙Y(jié)合良好。甲苯胺藍(lán)染色與周?chē)M織無(wú)明顯差別。實(shí)驗(yàn)對(duì)照組標(biāo)本缺損區(qū)由纖維結(jié)締組織填充,表面凹陷、粗糙,與周?chē)M織的愈合不良。修復(fù)組織厚度小于正常軟骨厚度。修復(fù)組織甲苯胺藍(lán)異染性差。空白對(duì)照

8、組標(biāo)本缺損區(qū)主要由纖維結(jié)締組織填充,僅缺損周邊出現(xiàn)少量軟骨,軟骨缺損仍部分存在,軟骨下骨部分修復(fù)。
　　 三組評(píng)分總體差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。術(shù)后8周、12周時(shí),實(shí)驗(yàn)組的組織學(xué)評(píng)分均優(yōu)于兩對(duì)照組(P＜0.05);空白對(duì)照組的組織學(xué)評(píng)分均優(yōu)于實(shí)驗(yàn)對(duì)照組(P＜0.05)。各組12周時(shí)的組織學(xué)評(píng)分均優(yōu)于6周。
　　 3Ⅱ型膠原免疫組化:術(shù)后12周,實(shí)驗(yàn)組修復(fù)組織中細(xì)胞呈圓形或橢圓形,呈現(xiàn)柱狀排列趨勢(shì),細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞外間