經(jīng)冠脈自體骨髓干細(xì)胞移植對(duì)急性心肌梗死后心室重構(gòu)影響的研究.pdf

1、背景：急性心肌梗死(AMI)后心室重構(gòu)(yentricular remodeling)指心肌梗死后心室的大小、結(jié)構(gòu)以及心臟功能的變化過(guò)程，主要包括心肌梗死區(qū)膨出，非梗死區(qū)心肌肥大、室壁增厚、心肌間質(zhì)纖維化，最終導(dǎo)致整個(gè)心室進(jìn)行性擴(kuò)張、心臟收縮功能減低，它已成為心肌梗死患者晚期死亡的主要原因。骨髓干細(xì)胞移植可改善心功能、預(yù)防心室重構(gòu)，但其機(jī)制尚不完全清楚，可能與以下途徑有關(guān)：抑制心肌重構(gòu)，阻止心肌細(xì)胞肥大和重構(gòu)；抑制基質(zhì)重構(gòu)，減少膠原沉積

2、和纖維化；促進(jìn)血管重構(gòu)，促進(jìn)毛細(xì)血管新生和原有血管系統(tǒng)增殖，減少心肌細(xì)胞凋亡。目前，成體干細(xì)胞成為心臟細(xì)胞移植的主要細(xì)胞源，常用于移植的成體骨髓干細(xì)胞有骨髓BM-MNC(BM-MNC)、骨髓MSCs (BMSCs)和內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)等。 目的：對(duì)比研究自體BM-MNC、MSCs對(duì)AMI后心室重構(gòu)的影響，探討不同干細(xì)胞移植對(duì)心室重構(gòu)影響的機(jī)理。評(píng)價(jià)經(jīng)冠狀動(dòng)脈BM-MNC和MSCs移植治療AMI的效果及其安全性，為臨床防治AM

3、I后心室重構(gòu)、治療心力衰竭提供安全、有效的方法。 方法：本研究以小型豬為研究對(duì)象，隨機(jī)分為對(duì)照組(假手術(shù)組)、單純AMI模型組、BM-MNC移植組、MSCs移植組。 1．通過(guò)穿刺股動(dòng)脈或頸總動(dòng)脈，用球囊導(dǎo)管壓迫冠狀動(dòng)脈前降支的方法，建立小型豬急性心肌梗死動(dòng)物模型。 2．采用密度梯度離心法分離BM-MNC，采用貼壁法分離、培養(yǎng)MSCs，利用膠體金進(jìn)行細(xì)胞標(biāo)記。 3．在急性心肌梗死90min時(shí)，進(jìn)行經(jīng)冠狀動(dòng)脈

4、腔內(nèi)自體BM-MNC和MSCs移植。 4．心功能評(píng)價(jià)：分別于術(shù)前、術(shù)后即刻、干細(xì)胞移植后28天進(jìn)行超聲心動(dòng)圖檢查，觀察心功能情況。 5．光、電鏡病理及免疫組化：對(duì)照組、單純AMI組及BM-MNC和MSCs組，分別于假手術(shù)、造模及細(xì)胞移植后28天，行心肌微血管計(jì)數(shù)、光鏡、透射電鏡檢查、心肌組織核因子kB、心肌細(xì)胞凋亡檢測(cè)、心肌增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen PCNA)免

5、疫組化檢測(cè)。 6.采用實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄.聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR.)的方法，于AMI后28天檢測(cè)心肌血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)的mRNA表達(dá)。 結(jié)果： 1.小型豬急性心肌梗死后心力衰竭模型的建立：36只豬完成了手術(shù)，28天后有31只成活。其中對(duì)照組存活6只、心肌梗死模型組及MSCs組各存活8只、BM-MNC組存活9只。球囊堵閉LAD2h ST 段抬高的幅度為(0.43±0.3

6、5mv)。對(duì)照組及用球囊堵閉LAD后24h模型組、單個(gè)核組、間充質(zhì)組CK水平分別為(112.50±70.23；1190.50±734.05；1162.55±837.23；1142.00±308.90 F=4.80，P=0.008)；CK-MB 水平分別為(15.33±5.85；121.62±74.11；101.77±79.65；105.25±42.42F=3.93，P=0.019)；cTnI水平分別為(2.48±1.13；49.66±4

7、4.73；55.05±47.42；45.61±26.73 F=2.78，P=0.06)。單純 AMI 模型組、單個(gè)核組、間充質(zhì)組比對(duì)照組血清心肌損傷標(biāo)志物cTnI和CK、CK-MB 水平均升高，差別有顯著性意義。單純AMI模型組、BM-MNC 和MSCs之間心肌損傷標(biāo)志物水平無(wú)顯著差異。 通過(guò)心臟超聲檢查發(fā)現(xiàn)術(shù)前各組的左室收縮末內(nèi)徑(ESD)、左室舒張末內(nèi)徑(EDD)、左室射血分?jǐn)?shù)(EF)、短軸縮短率(FS)均無(wú)顯著性差異。術(shù)后

8、2h時(shí)，正常對(duì)照組、AMI模型組、BM-MNC和MSCs組EF分別為(61.70±3.91％；46.2±23.62％；45.13±33.02；47.25±5.41 F=23.88P=0.0001)，AMI模型組、BM-MNC和MSCs組的EF值比正常對(duì)照組降低，差別有顯著性意義。AMI模型組、單個(gè)核組、間充質(zhì)組的組間EF值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 術(shù)后28天光鏡檢查發(fā)現(xiàn)，模型組的梗死區(qū)可見(jiàn)大片纖維化區(qū)，梗死區(qū)及邊緣區(qū)可見(jiàn)大量炎性細(xì)胞浸

9、潤(rùn)，干細(xì)胞移植組的梗死纖維化區(qū)及梗死邊緣區(qū)可見(jiàn)大量血管增生、炎細(xì)胞浸潤(rùn)。電鏡下梗死模型組、BM-MNC和MSCs組的心肌梗死區(qū)可見(jiàn)大量纖維母細(xì)胞增生。 2.骨髓BM-MNC和MSCs體外分離、培養(yǎng)、誘導(dǎo)分化和鑒定。骨髓細(xì)胞經(jīng)密度梯度離心后，可清楚觀察到介于分離液和血漿間的：BM-MNC層。 通過(guò)貼壁法獲得MSCs，72h可見(jiàn)細(xì)胞分散貼壁生長(zhǎng)，2-4天后細(xì)胞開(kāi)始快速增殖，集落逐漸增大，9-11天細(xì)胞集落間出現(xiàn)相互融合，大部

10、分呈長(zhǎng)梭形，胞核較大，可見(jiàn)處于分裂期的核仁，胞體肥大，胞質(zhì)豐富。集落達(dá)到80％-90％融合時(shí)進(jìn)行消化傳代，每瓶單層匯合的MSCs用胰蛋白酶消化后平均獲得5.5×10<'5>個(gè)MSCs，將這些細(xì)胞再傳代培養(yǎng)7天左右開(kāi)始匯合，繼續(xù)傳代擴(kuò)增。第10代以后的細(xì)胞增長(zhǎng)速度明顯減慢。 3.經(jīng)冠脈移植自體BM-MNC和MSCs對(duì)急性心肌梗死后心室重構(gòu)的影響。 心臟功能的變化：術(shù)后28天，正常對(duì)照組、BM-MNC組、MSCs組EDD均明顯低于模

11、型組(F=5.30，P=0.005)，EF及FS均明顯高于模型組(F=10.67，P=0.0001；F=6.64，P=0.0017)。正常對(duì)照組、BM-MNC組、MSCs組組間相比上述指標(biāo)無(wú)顯著性差異。正常對(duì)照組、模型組、BM-MNC組、間充質(zhì)干胞組室壁運(yùn)動(dòng)異常指數(shù)依次為(1；3.25±1.03；2.44±0.72；2.25±0.46 F=11.95,P=0.001)，模型組與BM-MNC和MSCs組相比有顯著性差異。BM-MNC和MS

12、Cs組運(yùn)動(dòng)異常指數(shù)相比無(wú)顯著性差異。 28天時(shí)處死動(dòng)物，光鏡下可見(jiàn)BM-MNC移植組：在梗死纖維化區(qū)及梗死邊緣區(qū)可見(jiàn)大量血管增生，梗死邊緣區(qū)可見(jiàn)有大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)。電鏡下BM-MNC組，可見(jiàn)較多的毛細(xì)血管"芽生"現(xiàn)象。MSCs移植組在梗死邊緣區(qū)可見(jiàn)不成熟的心肌細(xì)胞，胞核較小，可見(jiàn)膠體金顆粒。梗死模型組、BM-MNC組、MSCs移植組，在心肌梗死區(qū)、梗死邊緣區(qū)及正常區(qū)均可見(jiàn)心肌細(xì)胞凋亡。 血管數(shù)的變化：梗死區(qū)及梗死邊緣區(qū)的血

13、管數(shù)：梗死組、BM-MNC組、MSCs組比正常組的血管數(shù)增加，有非常顯著性差異；BM-MNC移植組血管數(shù)比梗死組及MSCs組增加，有非常顯著性差異(梗死區(qū)F=34.87P=0.0001，邊緣區(qū)F=29.56 P=0.0001)；無(wú)梗死的正常心肌區(qū)：梗死組、BM-MNC組及MSCs組比正常組的血管數(shù)增加，.有非常顯著性差異；BM-MNC移植組及間充質(zhì)組血管數(shù)比梗死組增加，有非常顯著性差異(F=14.74 P=0.0001)。 心肌

14、組織核因子kB陽(yáng)性率的變化：正常對(duì)照組與模型組、BM-MNC組、MSCs組的心肌梗死區(qū)的NF-kB陽(yáng)性率無(wú)顯著差異(F=1.02，P=0.397)；與正常組相比模型組、BM-MNC組、MSCs組的心肌梗死邊緣區(qū)的NF-kB陽(yáng)性率均顯著增加(F=19.05,P=0.001)；BM.MNC組及MSCs組NF-kB陽(yáng)性率比單純AMI模型組顯著降低；BM-MNC組、MSCs組間NF-kB陽(yáng)性率無(wú)顯著性差別；模型組、BM-MNC組、MSCs組的正

15、常區(qū)NF-kB陽(yáng)性率比正常組NF-kB陽(yáng)性率顯著升高(F=8.67，P=0.003)；模型組、BM-MNC組、MSCs組之間的正常區(qū)NF-kB陽(yáng)性率差異無(wú)顯著性意義。心肌細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果：梗死區(qū)心肌細(xì)胞凋亡：模型組、BM-MNC組、MSCs組的梗死區(qū)心肌細(xì)胞凋亡率比正常組的增加，差別有非常顯著性意義(F=14.31，P=0.0001)，模型組、BM-MNC組、MSCs組間心肌細(xì)胞凋亡率差別無(wú)顯著性意義。梗死邊緣區(qū)心肌細(xì)胞凋亡情況：模型組

16、、BM-MNC組、MSCs組心肌細(xì)胞凋亡率比正常組的增加，差別有非常顯著性意義(F=35.34，P=0.0001)；模型組比BM-MNC組及MSCs組心肌細(xì)胞凋亡率增加，差別有非常顯著性意義，BM-MNC組及MSCs組之間心肌細(xì)胞凋亡率差別無(wú)顯著性意義。正常區(qū)心肌細(xì)胞凋亡情況：模型組、BM-MNC組心肌細(xì)胞凋亡率比正常組的增加，差別有非常顯著性意義(F=5.33,P=0.0052)。 結(jié)論： 1.采用球囊封堵的方法成功建

17、立了心肌梗死后心力衰竭的動(dòng)物模型。 2.采用密度梯度離心法及貼壁法成功獲得骨髓BM-MNC 及MSCs，采用膠體金標(biāo)記，減少了標(biāo)記物對(duì)細(xì)胞的毒性作用。 3.經(jīng)冠脈自體BM-MNC及MSCs移植均可減輕心肌梗死后左心室重構(gòu)，改善急性心肌梗死后心功能，可顯著降低心肌梗死邊緣區(qū)NF-kB 表達(dá)，減輕梗死邊緣區(qū)及正常區(qū)心肌細(xì)胞凋亡。BM-MNC及MSCs移植可顯著增加梗死區(qū)、梗死邊緣區(qū)及正常區(qū)血管數(shù)量；增加梗死區(qū)及梗死邊緣區(qū)VE

18、GF及bFGF表達(dá)。BM-MNC及MSCs移植后，移植細(xì)胞可在梗死部位心肌內(nèi)存活。 4.心功能的改善與干細(xì)胞移植后增加心肌血管數(shù)量、增加心肌VEGF及bFGF表達(dá)、減少心肌細(xì)胞凋亡以及減少心肌組織NF-kB水平有關(guān)。 5.BM-MNC移植組促心肌血管增生作用優(yōu)于MSCs組，BM-MNC移植組梗死邊緣區(qū)心肌VEGF的表達(dá)優(yōu)于MSCs組。MSCs移植后bFGF 基因表達(dá)量比BM-MNC組顯著增加。MSCs移植組膠體金標(biāo)記細(xì)胞