腺病毒介導(dǎo)的心肌營養(yǎng)素-1對大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)方向分化及存活的作用.pdf

1、目的:體外培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(rBMSCs)，Adv-EGFP-CT-1（重組心肌營養(yǎng)素-1腺病毒）轉(zhuǎn)染rBMSCs，觀察CT-1對rBMSCs向神經(jīng)方向分化的作用及對其存活的影響。
　　 方法:(1)培養(yǎng)及鑒定rBMSCs:全骨髓貼壁篩選法分離培養(yǎng)rBMSCs，流式細(xì)胞術(shù)鑒定細(xì)胞表面標(biāo)記性蛋白。(2) Adv-EGFP-CT-1轉(zhuǎn)染rBMSCs:將Adv-EGFP-CT-1分別以感染復(fù)數(shù)(MOI)為100、200、300

2、、400 PFU/細(xì)胞轉(zhuǎn)染rBMSCs，于轉(zhuǎn)染后24h、48h、72h、96h在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染率，流式細(xì)胞術(shù)鑒定其最佳MOI及最佳時間點（熒光顯微鏡下觀察所得）轉(zhuǎn)染率。同時于轉(zhuǎn)染后24h、48h、3d、10d應(yīng)用Real-timePCR檢測轉(zhuǎn)染后rBMSCs表達(dá)CT-1 mRNA的情況、應(yīng)用細(xì)胞免疫熒光檢測轉(zhuǎn)染后rBMSCs表達(dá)CT-1目的蛋白的情況，確定CT-1蛋白表達(dá)最強(qiáng)的時間點。(3)觀察CT-1對rBMSCs向神經(jīng)方向分化

3、的作用:將rBMSCs分為以下4組:對照組、Adv-EGFP（重組腺病毒增強(qiáng)型綠色熒光蛋白）轉(zhuǎn)染組（Adv-EGFP轉(zhuǎn)染rBMSCs，MOI為200PFU/細(xì)胞）、Adv-EGFP-CT-1轉(zhuǎn)染組(Adv-EGFP-CT-1轉(zhuǎn)染rBMSCs，MOI為200PFU/細(xì)胞)及誘導(dǎo)劑組。除對照組外，其他各組均予神經(jīng)分化誘導(dǎo)，于誘導(dǎo)后5h、3d、7d觀察各組細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化、細(xì)胞免疫熒光檢測各組Nestin、NeuN、GFAP的表達(dá)。(4)觀察C

4、T-1對rBMSCs神經(jīng)分化過程中細(xì)胞存活的影響:于誘導(dǎo)后5h、24h、48h DAPI染色法觀察凋亡細(xì)胞核形態(tài);流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞的早期凋亡率;于誘導(dǎo)后5h、3d、7d臺盼藍(lán)染色法檢測細(xì)胞存活率。
　　 結(jié)果:(1)rBMSCs的培養(yǎng)及鑒定。rBMSCs原代細(xì)胞7天左右可以傳代，第三代(P3)得到純化，流式細(xì)胞術(shù)鑒定CD29、CD90、CD45的陽性率分別是99.27％、93.43％、1.46％。(2) Adv-EGFP-CT

5、-1的轉(zhuǎn)染率。其轉(zhuǎn)染率隨MOI及時間的改變而變化，MOI為200 PFU/細(xì)胞、轉(zhuǎn)染后48h達(dá)高峰(轉(zhuǎn)染率為87.05％±0.95％); Adv-EGFP-CT-1轉(zhuǎn)染rBMSCs后CT-1 mRNA的表達(dá):轉(zhuǎn)染后24h CT-1 mRNA的相對表達(dá)量(423.42±11.61)均高于其他時間點(48h、3d、10d)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，48h、3d、10d之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);Adv-EGFP-CT-1

6、轉(zhuǎn)染rBMSCs后CT-1目的蛋白的表達(dá):轉(zhuǎn)染后48h，CT-1熒光強(qiáng)度達(dá)到最強(qiáng)(11.44±1.44)，與24h相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，與3d、10d相比熒光強(qiáng)度差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。(3) CT-1對rBMSCs向神經(jīng)方向分化的作用。誘導(dǎo)處理后，除對照組外，其他各組均顯示類神經(jīng)細(xì)胞樣形態(tài)改變，其中CT-1組此變化最明顯;誘導(dǎo)后5h Nestin的陽性率最高，其中CT-1組的陽性率均高于其他各組（86.31％

7、±4.27％），差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);誘導(dǎo)后5h CT-1組NeuN、GFAP即有少量表達(dá)，隨后NeuN、GFAP陽性率逐漸升高，至第7d時陽性率最高，其中，CT-1組各時間點NeuN、GFAP陽性率均高于其他各組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。(4) CT-1對rBMSCs神經(jīng)分化過程中細(xì)胞存活的影響。CT-1組及對照組，細(xì)胞核大部分為淡藍(lán)色圓形或橢圓形，而空病毒組及誘導(dǎo)劑組出現(xiàn)較多凋亡細(xì)胞核;誘導(dǎo)后各時間點，CT-1

8、組及對照組早期凋亡率較空病毒組及誘導(dǎo)劑組明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);誘導(dǎo)后不同時間點，CT-1組及對照組存活率均高于空病毒組及誘導(dǎo)劑組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:(1)全骨髓貼壁篩選法可以獲得純化的rBMSCs;(2) Adv-EGFP-CT-1可以有效地轉(zhuǎn)染rBMSCs，CT-1可在rBMSCs中高效長期表達(dá);(3) CT-1可以促進(jìn)rBMSCs向神經(jīng)方向分化;(4) CT-1修飾的rBM