腺病毒介導(dǎo)的膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子基因通過Wnt信號通路誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)樣細(xì)胞分化.pdf

1、目的:
　　觀察腺病毒介導(dǎo)的膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)基因?qū)Υ笫蠊撬栝g充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)向神經(jīng)樣細(xì)胞分化的影響，并進(jìn)一步研究Wnt信號通路在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)樣細(xì)胞分化中的作用。
　　方法:
　　分離、培養(yǎng)BMSCs，流式細(xì)胞儀鑒定其細(xì)胞表型分子CD11b、CD34、CD29、CD90。將第3代培養(yǎng)的BMSCs分為3組:轉(zhuǎn)染組、DKK-1組、對照組。轉(zhuǎn)染組以載膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子和綠色熒光蛋白基

2、因重組腺病毒(AD-GDNF-GFP)轉(zhuǎn)染BMSCs，DKK-1組以AD-GDNF-GFP轉(zhuǎn)染BMSCs同時加入DKK-1以阻斷Wnt信號通路，對照組僅以含10％胎牛血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。于轉(zhuǎn)染后第1、5、7、14天熒光顯微鏡下觀察BMSCs對綠色熒光蛋白GFP的表達(dá)情況并以Western blot技術(shù)檢測轉(zhuǎn)染組BMSCs對GDNF蛋白的表達(dá)情況。MTT法測定轉(zhuǎn)染后BMSCs活力。于轉(zhuǎn)染后以免疫熒光技術(shù)檢測BMSCs對神經(jīng)特異性蛋白N

3、SE、MAP-2、β-TublinⅢ的表達(dá)情況。RT-PCR檢測BMSCs對神經(jīng)營養(yǎng)因子bFGF、EGF、BDNF、NT-3基因的表達(dá)情況。為探討Wnt信號通路在腺病毒介導(dǎo)的膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子基因誘導(dǎo)BMSCs神經(jīng)分化過程中的作用，轉(zhuǎn)染后以免疫熒光、蛋白質(zhì)印跡技術(shù)檢測β-catenin、NSE的表達(dá)情況，并應(yīng)用RT-PCR法進(jìn)一步檢測Wnt信號通路相關(guān)分子Wnt1a、Wnt3a、Wnt7a基因表達(dá)水平。
　　結(jié)果:
　

4、　第3代培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞呈魚群樣、漩渦狀貼璧生長，高表達(dá)CD29、CD90，陽性率分別為99.8％、95.6％;低表達(dá)CD11b、CD34，且陽性率分別為1.4％，1.5％。載GDNF基因重組腺病毒轉(zhuǎn)染BMSCs24小時后，在熒光顯微鏡下即可觀察到綠色熒光蛋白GFP的表達(dá)，隨著時間的延長熒光蛋白GFP的熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，轉(zhuǎn)染7天后綠色熒光蛋白GFP的熒光強(qiáng)度最高，轉(zhuǎn)染后14天熒光強(qiáng)度明顯減弱。分別于轉(zhuǎn)染后第1天、3天、7天、14天

5、以Western Blot技術(shù)均可檢測到GDNF蛋白的表達(dá)。轉(zhuǎn)染后5天，免疫熒光技術(shù)檢測結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染組BMSCs表達(dá)NSE，轉(zhuǎn)染后10天MAP-2、β-TublinⅢ呈陽性表達(dá)，且多數(shù)細(xì)胞呈典型的神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)，胞體明顯皺縮并向周圍形成突起。而對照組均未見NSE、MAP-2、β-Tub linⅢ表達(dá)。轉(zhuǎn)染5天后免疫熒光技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染組β-catenin、NSE呈陽性表達(dá)，而DKK-1組β-catenin熒光強(qiáng)度明顯低于對照組，對照組未見

6、β-catenin表達(dá)，且DKK-1組、對照組無NSE表達(dá)。RT-PCR檢測結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染組Wnt信號通路相關(guān)分子Wnt1a、Wnt3a、Wnt7a基因表達(dá)量明顯上調(diào)，與DKK-1組及對照組比較存在明顯差異，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　(1)腺病毒介導(dǎo)的膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子基因可以促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)神經(jīng)元標(biāo)志蛋白，能誘導(dǎo)其向神經(jīng)樣細(xì)胞分化;
　　(2)腺病毒介導(dǎo)的膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子