心肌營養(yǎng)素1促進人臍血間充質(zhì)干細胞神經(jīng)分化存活及PI3K-Akt信號通路機制研究.pdf

1、目的：研究心肌營養(yǎng)素1（CT1）對人臍血間充質(zhì)干細胞（hUCB-MSCs）向神經(jīng)方向誘導(dǎo)及存活的作用，并探討磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶 B（PI3K/Akt）信號通路在此過程中的機制。
　　方法：（1）通過密度梯度離心結(jié)合貼壁篩選法從人臍血中分離、培養(yǎng)、純化間充質(zhì)干細胞（MSCs），流式細胞術(shù)鑒定；（2）采用不同感染復(fù)數(shù)（50，100，200 PFU/cell）的Adv-CT1-EGFP轉(zhuǎn)染 hUCB-MSCs，摸索最佳轉(zhuǎn)染復(fù)數(shù)

2、；（3）選用感染復(fù)數(shù)100 PFU/cell轉(zhuǎn)染 hUCB-MSC后，用谷氨酸、無血清高糖及維甲酸為神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基(NIM)，利用免疫熒光技術(shù)檢測誘導(dǎo)后6h及4d神經(jīng)蛋白巢蛋白（nestin）及β-微管蛋白Ⅲ（βⅢ-tubulin）表達；（4）CCK8及TUNEL技術(shù)檢測神經(jīng)誘導(dǎo)分化后6h及4d細胞存活及凋亡率；（5）加或不加PI3K/Akt特異性阻斷劑LY294002，用Western blot法分別檢測神經(jīng)誘導(dǎo)分化后細胞Akt、p-

3、Akt及凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bak、Bcl-2、caspase3及cleved-caspase3表達。
　　結(jié)果：（1）密度梯度結(jié)合貼壁篩選法可培養(yǎng)分離出高表達CD29、CD44、CD105，不表達 CD34的hUCB-MSCs；（2）感染復(fù)數(shù)為100PFU/cell轉(zhuǎn)染效率最佳（81.86±2.82％）；(3)誘導(dǎo)分化6h細胞呈類神經(jīng)樣改變（胞質(zhì)向胞核皺縮）；NIM+CT1組nestin陽性表達率>單純NIM組（88.57%±2

4、.81 vs.79.31%±2.60，P<0.05）；誘導(dǎo)分化后4d細胞呈典型神經(jīng)樣改變(胞質(zhì)伸出細長突起交織成網(wǎng)狀)，NIM+CT1組βⅢ-tubulin陽性表達率>單純NIM組（55.44±2.09%vs.40.93±2.55%，P<0.05）。（4） CCK8測得 NIM+CT1組神經(jīng)誘導(dǎo)分化后細胞6h、4d存活率均高于單純 NIM組（91.00±1.82%vs.82.63±2.03%；81.09±4.02%vs.55.70±12

5、.40%，P<0.05），TUNEL測得NIM+CT1組神經(jīng)誘導(dǎo)分化后6h、4d細胞凋亡率均低于單純NIM組（20.60±2.55%vs.35.41±4.11%；26.81±2.28%vs.57.73±2.23%，P<0.05）；（5）Western blot檢測發(fā)現(xiàn)NIM+CT1組較單純NIM組高表達p-Akt、Bcl-2，低表達Bax、Bak、cleved-caspase3，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），這一作用可被 PI3K