抑制PI3K-Akt信號(hào)通路促進(jìn)急性早幼粒細(xì)胞耐藥株(NB4-R1)分化的研究.pdf

1、目的：
　　研究抑制急性早幼粒細(xì)胞白血病維甲酸耐藥 NB4-R1細(xì)胞 PI3K/Akt信號(hào)通路后，NB4-R1細(xì)胞對(duì)他米巴羅汀（Am80）、全反式維甲酸（ATRA）敏感性改變，探討 PI3K/Akt信號(hào)通路與急性早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞耐藥株 NB4-R1細(xì)胞分化的相關(guān)性，為尋找APL分化機(jī)理及克服耐藥提供新的思路。
　　方法：
　　使用PI3K/Akt抑制劑CAL-101處理NB4-R1細(xì)胞，不同藥物濃度(3μmol/L

2、、5μmol/L、7μmol/L、9μmol/L、12μmol/L)處理72h和9μ mol/L CAL-101處理不同時(shí)間（24h、48h、72h、96h、120h），實(shí)時(shí)熒光定量（ Quantative Real-time PCR）、Western blot檢測(cè)PI3KCA、Akt1基因與蛋白表達(dá)量的改變。NB4-R1細(xì)胞分為空白組、溶劑組(無水乙醇、DMSO)、ATAR組、ATRA+CAL-101組， Am80組，Am80+ CA

3、L-101組（Am80和 ATRA藥物濃度為30μmol/L、CAL-101為9μmol/L）與細(xì)胞共培養(yǎng)48h、96h、144h后，瑞氏染色觀察細(xì)胞形態(tài)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面分化抗原 CD11b、CD13、CD16表達(dá)，實(shí)時(shí)熒光定量（Quantative Real-time PCR）檢測(cè)PML-RARα融合基因的mRNA表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　　1、CAL-101有效抑制NB4-R1細(xì)胞PI3KCA、Akt1基因及蛋白

4、表達(dá)，其抑制程度與CAL-101濃度升高呈正相關(guān)（P＜0.05）。72小時(shí)9μmol/L CAL-101抑制 PICKCA基因相對(duì)表達(dá)率為（0.437±0.025）；3μ mol/L CAL-101抑制 Akt1基因的相對(duì)表達(dá)率為（0.525±0.043）。9μ mol/L的 CAL-101作用72h Akt1基因相對(duì)表達(dá)率為(0.114±0.025），9μ mol/L組 Akt1蛋白表達(dá)量較空白組（0.195±0.037）VS（1.6

5、72±0.103）顯著降低（p＜0.05）。
　　2、9μmol/L CAL-101作用于 NB4-R1細(xì)胞株不同時(shí)間，PI3KCA、Akt1基因及蛋白表達(dá)下降水平與作用時(shí)間呈正相關(guān)。PI3KCA基因表達(dá)量24h組較對(duì)照組差異不顯著（P＞0.05），48h組較空白組降低（P＜0.05）；Akt1基因相對(duì)表達(dá)量各藥物組與對(duì)照組比較均顯著下降（P＜0.05）。PI3K p110δ蛋白量24h組較空白組、48h組較空白組差異不顯著（P＞

6、0.05）；Akt1蛋白量各藥物組較空白組顯著下降（ p＜0.05）。24h、48h、72h組 Akt蛋白表達(dá)量分別為（0.816±0.059）、（0.531±0.022）、（0.311±0.107）。
　　3、形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn) ATAR組， ATAR+ CAL-101組， Am80組， Am80+CAL-101組，空白組，溶劑組48h均未見 NB4-R1細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了明顯變化，96小時(shí)各藥物組均可見大量中、晚幼粒細(xì)胞，144h各藥

7、物組大部分細(xì)胞均已分化成熟，同時(shí)間段 CAL-101+ATRA、 CAL-101+Am80組細(xì)胞分化成熟更明顯。
　　4、細(xì)胞表面分化抗原隨著藥物作用時(shí)間的延長(zhǎng)， CD13表達(dá)逐漸下降， CD11b、CD16表達(dá)逐漸上升。48h各藥物組CD11b均未見明顯表達(dá)，與空白組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；各藥物組 CD13陽性表達(dá)率較空白組降低（P＜0.05），各藥物組間相互比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；48h各藥物組較

8、空白組CD16陽性細(xì)胞表達(dá)率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
　　96h各藥物組較空白組 CD11b陽性表達(dá)率顯著升高（P＜0.05），兩組之間相互比較，雙藥物組較單藥物組表達(dá)率升高（P＜0.05）；各藥物組 CD13陽性表達(dá)率趨近于零，CAL-101+Am80組較 Am80、CAL-101+ATRA組較 ATRA組表達(dá)率高（ P＜0.05）；各藥物組較空白組 CD16陽性表達(dá)率顯著升高（ P＜0.05），雙藥物組較單藥物組表達(dá)

9、升高（P＜0.05）。
　　144h各藥物組 CD11b陽性表達(dá)率接近最大值， Am80組較 ATRA組、Am80+CAL-101組較 Am80組、ATRA+CAL-101組 ATRA組 CD11b陽性表達(dá)率升高（P＜0.05），其它各藥物組之間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；CD13陽性表達(dá)率于零，各藥物組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；CD16陽性表達(dá)率CAL-101+Am80組較 CAL-101+ATRA組、Am80組

10、較 ATRA組表達(dá)升高（P＜0.05）。
　　5、PML-RARα基因表達(dá)水平隨著藥物作用時(shí)間逐漸下降，雙藥物組最顯著。48h各藥物組 PML-RARα基因相對(duì)表達(dá)量較空白組表達(dá)下降（P＜0.05）， Am80組較 ATRA組、CAL-101+AM80組較 Am80組、CAL-101+ATRA組較ATRA組基因表達(dá)下降（P＜0.05）。96h CAL-101+AM80組較 Am80組、CAL-101+ATRA組較ATRA組基因表達(dá)

11、下降（P＜0.05）。144h CAL-101+AM80組較Am80組、CAL-101+ATRA組較ATRA組基因表達(dá)下降（P＜0.05）。
　　結(jié)論：
　　1、CAL-101能抑制 PI3K/Akt信號(hào)通路，降低 PI3K、Akt基因及其蛋白表達(dá)量，其作用強(qiáng)度與濃度、作用時(shí)間呈正相關(guān)。
　　2、Am80可有效誘導(dǎo)NB4-R1細(xì)胞分化，誘導(dǎo)分化效應(yīng)較ATRA有效。
　　3、抑制 PI3K/Alt信號(hào)通路后 NB4