體外誘導(dǎo)人臍血間充質(zhì)細(xì)胞分化為類雪旺細(xì)胞.pdf

1、目的：探索一種有效的誘導(dǎo)方法將人臍血間充質(zhì)細(xì)胞（Human umbilical cord blood mesenchymal stem cells，HUCBMSCs）在體外定向誘導(dǎo)分化為類雪旺細(xì)胞(Schwann cell，SC)。
　　方法：（1）用一次性塑料血袋（100ml，0.0048／ml枸櫞酸、0.0132／ml枸櫞酸鈉、0.0147／ml葡萄糖）在無菌狀態(tài)下采集足月妊娠、正常分娩或剖腹產(chǎn)胎兒的新鮮臍帶血60-100ml

2、。用0.5％羥乙基淀粉按1:4比例加入臍血中混勻，再按1:1比例加入磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered solution，PBS）混勻。靜置30 min后，吸取上清,離心沉淀紅細(xì)胞。然后用密度為1.077g/ml的人淋巴分離液通過密度梯度離心法分離后，用吸管小心吸取中間白色膜狀細(xì)胞層。用PBS洗滌后接種在加有人間充質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基（Medium for human mesenchymal stem cells， MESEN

3、CULTTM，含人間充質(zhì)細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基和刺激生長(zhǎng)添加物）的一次性塑料培養(yǎng)瓶中，觀察細(xì)胞形態(tài)并傳代。（2）取培養(yǎng)的細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞是否表達(dá)表面抗原 CD34、CD45、CD90和SH2。（3）實(shí)驗(yàn)方案的選擇：參考誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)細(xì)胞（Bone marrow mesenchymal stem cells, BMMSCs）和脂肪間充質(zhì)細(xì)胞（Adipose-derived mesenchymal stem cells，A-DMSCs）分化

4、為類SC的方法，設(shè)計(jì)六種方案。其中方案五為HUCBMSCs傳至第3代，加入加有0.25mmol/mlβ-巰基乙醇（β-mercaptoethanol，β-ME）、20ng/ml全反式黃酸（retinoic acid，RA）、2.5μmol/ml Forskolin、5ng/ml bFGF、20ng/ml PDGF、100 ng/ml HRG的不含胎牛血清（Fetal bovine serum，F(xiàn)BS）的達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基（Dulb

5、ecco's modified eagle's medium，DMEM）培養(yǎng)24小時(shí)，然后換用10%FBS的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)24小時(shí)，再換用加有上述誘導(dǎo)劑的培養(yǎng)液培養(yǎng)24小時(shí)，再換用10%FBS的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)2d，再換10%FBS的DMEM培養(yǎng)液一次，培養(yǎng)2d。。在誘導(dǎo)7d后，計(jì)算出六種不同誘導(dǎo)方案的死亡細(xì)胞數(shù)和死亡率，統(tǒng)計(jì)六種不同誘導(dǎo)方案的死亡率之間的差異,取死亡率最小的方案五作為實(shí)驗(yàn)方案。（4）體外誘導(dǎo)HUCBMSCs向類S

6、C分化。實(shí)驗(yàn)組，按方案五誘導(dǎo)；對(duì)照組不加誘導(dǎo)劑,用10% FBS的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，每隔2天換液一次。用倒置顯微鏡觀察兩組實(shí)驗(yàn)細(xì)胞形態(tài)，誘導(dǎo)7天后用抗S-100、GFAP和P75抗體做細(xì)胞免疫組織化學(xué)染色來鑒定誘導(dǎo)后HUCBMSCs是否具有SC的特征。
　　結(jié)果：（1）HUCBMSCs在體外培養(yǎng)梭形細(xì)胞為主，呈成纖維細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞平行排列或旋渦狀生長(zhǎng)，胞漿豐富，核大。（2）流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示細(xì)胞表達(dá)間充質(zhì)細(xì)胞（mesenchym

7、al stem cells, MSCs）表面抗原CD90和SH2，不表達(dá)造血干細(xì)胞表面抗原CD34和白細(xì)胞表面抗原CD45。（3）在誘導(dǎo)7d后，計(jì)算出六種不同誘導(dǎo)方案的死亡細(xì)胞數(shù)和死亡率，統(tǒng)計(jì)六種不同誘導(dǎo)方案的死亡率之間的差異， p＜0.05，死亡率差異之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，取死亡率最小的方案五為實(shí)驗(yàn)方案。（4）加入誘導(dǎo)劑后有少量細(xì)胞死亡，加誘導(dǎo)劑的細(xì)胞免疫組化陽(yáng)性，細(xì)胞胞漿中有棕黃色顆粒，而未加誘導(dǎo)劑的細(xì)胞免疫組化陰性,細(xì)胞胞漿呈藍(lán)色。誘