白藜蘆醇體外誘導人臍帶間充質干細胞分化為神經(jīng)樣細胞.pdf

1、目的：體外培養(yǎng)分離純化的人臍帶間充質干細胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUC-MSCs)，觀察其生長情況及形態(tài)，并檢測其表面標志物；探索白藜蘆醇（Resveratrol）在不同濃度下體外定向誘導hUC-MSCs分化為神經(jīng)樣細胞的條件及作用；觀察其形態(tài)學改變，檢測其基因與蛋白表達水平；為其將來參與基礎與臨床治療提供新的理論支持和技術保證。
　　方法：取剖宮產(chǎn)健康足月胎兒的

2、臍帶，剔除臍動脈和臍靜脈后用D-Hank’s充分沖洗，將獲得的臍帶間質組織分為大約1mm3大小的組織塊，用0.2％膠原酶Ⅱ消化，放入含有20%胎牛血清（FBS）、2ng/ml表皮細胞生長因子（EGF）、25mM左旋谷氨酰胺（L-Glu）、100U/ml青霉素，100μg/ml鏈霉素的DMEM/F12中培養(yǎng)。觀察獲得的原代細胞的形態(tài)及生長趨勢，當細胞融合達約80%～90%時，加入0.25%胰酶-1mM EDTA消化細胞，并傳代。
　

3、　通過流式細胞術檢測消化細胞的細胞表型，包括CD105、CD73、CD90、CD11b、CD45、CD34、CD19以及組織相容性抗原HLA-DR(MHC-II)，用抗鼠IgG1-PE和IgG1-FITC作為同型對照。
　　取原代hUC-MSCs按1:1傳代，記為P1代，倒置顯微鏡下動態(tài)觀察細胞形態(tài)及生長變化情況，當細胞融合率達到90%以上時，根據(jù)細胞生長狀況按1:2或1:3比例進行傳代，繪制細胞生長曲線。
　　將處于對數(shù)生

4、長期增殖迅速的P5代 hUC-MSCs傳代至六孔板及25cm2塑料培養(yǎng)瓶中，使用全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，當細胞融合率達約70%-80%時，隨機將1個六孔板及3個培養(yǎng)瓶組合為1組，分為四組，前三組作為實驗組，第四組為對照組，實驗組分別為7.5mg/L、15mg/L、30mg/L的白藜蘆醇（Resveratrol）誘導液，誘導液均用無血清L-DMEM培養(yǎng)基配制，各組中六孔板每孔含誘導液2ml，每培養(yǎng)瓶中含誘導液4ml,對照組只加無血清L-DMEM

5、培養(yǎng)基，將各組置于CO2培養(yǎng)箱（CO25%，37℃）中誘導，培養(yǎng)條件同前，繼續(xù)培養(yǎng)24小時。倒置相差顯微鏡動態(tài)觀察細胞的形態(tài)變化，并于各組中隨機選取10個非重疊視野，拍照記錄視野內(nèi)總細胞數(shù)及神經(jīng)樣細胞的數(shù)量，計算神經(jīng)樣細胞在視野內(nèi)所占的比例，結果以X±s表示。四組中誘導于六孔板的細胞于誘導后第4小時終止誘導，采用免疫細胞化學染色檢測各組細胞膠質纖維酸性蛋白（GFAP)、巢蛋白（Nestin）和神經(jīng)元特異性烯醇化酶（NSE）的表達情況。然

6、后選取較合適的濃度，使誘導于培養(yǎng)瓶的細胞分別于誘導后2、4、6、12、24小時棄去誘導液，用PBS洗滌3次，用Western blot及RT-PCR的方法檢測各組細胞膠質纖維酸性蛋白（GFAP)、巢蛋白（Nestin）和神經(jīng)元特異性烯醇化酶（NSE）的表達情況。
　　結果：原代hUC-MSCs傳代培養(yǎng)12h后，大多數(shù)細胞貼壁生長，細胞呈梭形或三角形，隨培養(yǎng)時間增加，細胞增殖迅速，貼壁數(shù)量明顯增多，形狀變大，呈長梭形排列。傳代至第5

7、d可見細胞呈完全融合狀態(tài)，以螺旋狀或放射狀方式排列生長。此后可以按照1：2或1：3的比例進行消化傳代進行新一輪的培養(yǎng)，如果沒有傳代并且繼續(xù)培養(yǎng)的活細胞在貼壁的基礎上會呈螺旋重疊樣生長，導致局部密度增高。連續(xù)傳代培養(yǎng)多次后仍具有較強的增殖能力。
　　通過流式細胞術檢測P2、P5及P10代細胞的細胞表型，均表達CD105、CD73及CD90，不表達CD11b、CD45、CD34、CD19以及組織相容性抗原HLA-DR(MHC-II)。

8、
　　加入誘導液培養(yǎng)，15mg/L組誘導1h后細胞未見明顯形態(tài)及外觀變化，4h后極個別細胞胞體略微收縮，折光性稍顯增強，未見突起，并且有少量細胞脫離瓶壁，但未完全脫離漂浮，6h后胞體收縮的細胞數(shù)量略顯增多，折光性明顯增強，呈橢圓形或類圓形，伸出兩條或多條長短及粗細不一的細長條突起，突起有分支，數(shù)量不等，多數(shù)為雙極細胞，此時視野中神經(jīng)樣細胞比率僅為5%左右。12h時神經(jīng)樣細胞未見明顯增多甚至減少，且存在少量漂浮細胞；30mg/L組誘

9、導1h后神經(jīng)樣細胞陽性率可達50%，多級分化細胞數(shù)量較15mg/L組驟增，細胞突起及分支更長，數(shù)量更多，各個細胞之間借助伸出的突起及其分支相互交織成網(wǎng)狀，4h時陽性細胞比例增加至70%左右，僅見極個別細胞漂浮，6h后可見神經(jīng)樣細胞占視野85%-90%，漂浮細胞較之前稍顯增多，12h后神經(jīng)樣細胞比率無明顯增加，且漂浮細胞數(shù)量增多，24h神經(jīng)樣細胞比例已經(jīng)降低至70%-80%，漂浮細胞及未完全脫離瓶底的擺動細胞數(shù)量進一步增多；7.5mg/L

10、組與空白對照組誘導前后相比較無明顯改變，且7.5mg/L組有少量細胞漂浮。當誘導4h時，免疫組織化學染色技術檢測結果為15mg/L組和30mg/L組細胞陽性表達Nestin和NSE，GFAP為陰性，陽性細胞可見棕黃色的胞體及紫色胞核。30mg/L組細胞隨時間誘導的神經(jīng)樣細胞比率均高于其他組。Western blot及RT-PCR檢測結果顯示各組GFAP的蛋白及mRNA表達均為陰性。Nestin和NSE的蛋白及mRNA在空白組均有少量表達

11、，Nestin蛋白及mRNA隨誘導時間的延長而顯著提升，誘導4h時最高，之后降低。NSE蛋白及mRNA隨著誘導時間延長逐漸增加，到6h時為最高，其后逐漸降低。
　　結論：hUC-MSCs從人臍帶中分離純化后能夠在體外穩(wěn)定培養(yǎng)及傳代，并維持較高的活性；傳代培養(yǎng)的hUC-MSCs表達間充質干細胞表型CD105、CD73及CD90，不表達造血干細胞表面標志CD11b、CD45、CD34、CD19以及組織相容性抗原HLA-DR(MHC-I