臍血間充質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)分化成肝細(xì)胞及治療肝損傷的研究.pdf

1、目的:將來源于健康產(chǎn)婦的臍帶血進(jìn)行體外分離、培養(yǎng)出間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymalstemcells，MSCs)，在特定環(huán)境下誘導(dǎo)成肝樣細(xì)胞并進(jìn)行鑒別，觀察MSCs及肝樣細(xì)胞對(duì)大鼠慢性肝損傷的修復(fù)作用，為終末期肝病的肝細(xì)胞移植治療和生物型人工肝提供一種新的細(xì)胞來源。 方法:采集正常產(chǎn)婦臍帶血，密度梯度離心法和貼壁法分離、培養(yǎng)、純化臍血MSCs；流式細(xì)胞儀檢測(cè)MSCs表面抗原CD34、CD44表達(dá)情況；用肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(hep

2、atocytegrowthfactor，HGF)及成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-4(Fibroblastgrowthfactor-4)聯(lián)合誘導(dǎo)P3代的MSCs成肝樣細(xì)胞；采用免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)肝樣細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)情況并進(jìn)行糖原染色檢測(cè)細(xì)胞糖原表達(dá)；采用透射電鏡觀察MSCs和誘導(dǎo)的肝樣細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)；將MSCs及誘導(dǎo)后的肝樣細(xì)胞輸注入慢性肝損傷的大鼠體內(nèi)，取肝臟病理，觀察兩者對(duì)肝損傷的修復(fù)情況。 結(jié)果 1.接種的MSCs于48～72

3、h后貼壁，巢樣克隆，梭形，折光性強(qiáng)，3天后梭形細(xì)胞體積開始增大，15天后出現(xiàn)梭形細(xì)胞集落，呈平行或火焰狀排列或漩渦狀生長(zhǎng)，三周后細(xì)胞呈80～90％融合；細(xì)胞傳至第三代時(shí)，呈較均一的長(zhǎng)梭形，形態(tài)基本無(wú)變化。 2.經(jīng)過傳代、純化、誘導(dǎo)的細(xì)胞經(jīng)3～4周，呈放射狀的細(xì)胞排列結(jié)構(gòu)逐步消失，長(zhǎng)梭形細(xì)胞變類圓形或多角形，存在離散現(xiàn)象，胞漿出現(xiàn)顆粒，部分出現(xiàn)雙核。 3。標(biāo)志物檢測(cè)：非誘導(dǎo)組始終沒有見到肝細(xì)胞的標(biāo)志物白蛋白(albium，

4、ALB)、糖原表達(dá)，甲胎蛋白(alphafetoprotein，AFP)第0天有少量表達(dá)，此后不再表達(dá)；誘導(dǎo)組可以檢測(cè)到肝細(xì)胞的標(biāo)志物AFP、ALB和糖原的明顯的表達(dá)。 4.培養(yǎng)至第三代的細(xì)胞表面抗原為CD44+/CD34-的細(xì)胞占(98.59±4.53)％。 5.移植了人MSCs及誘導(dǎo)后的肝樣細(xì)胞的大鼠肝損傷病理輕于無(wú)治療組，肝樣細(xì)胞組的病理?yè)p傷輕于MSCs組。 結(jié)論: 1.使用密度梯度離心法和貼壁法相