骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和P19細(xì)胞體外誘導(dǎo)向心肌分化及細(xì)胞移植修復(fù)梗死心肌的研究.pdf

1、急性心肌梗死是嚴(yán)重危害中老年人身體健康的常見(jiàn)病、多發(fā)病。目前臨床缺乏針對(duì)患者梗死心肌的再造和再生的根本性治療方法，雖然發(fā)病4-6小時(shí)內(nèi)及時(shí)溶栓、介入治療使梗死相關(guān)血管早期持續(xù)開(kāi)通可挽救瀕臨死亡的心肌細(xì)胞，但絕大多數(shù)患者就診時(shí)缺血心肌已有壞死，此時(shí)再灌注治療只能防止梗死范圍的擴(kuò)大，而對(duì)于已壞死的心肌無(wú)效。由于成人心肌組織無(wú)分化再生能力，其壞死心肌細(xì)胞只能由成纖維細(xì)胞取代而形成無(wú)收縮功能的瘢痕組織，終致心衰，甚至猝死，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量和

2、壽命。在這種情況下，有人提出可以通過(guò)再生心肌細(xì)胞，即心肌細(xì)胞成形術(shù)，來(lái)治療缺血性心肌病導(dǎo)致的心肌梗死甚至心力衰竭，也就是通過(guò)移植外源性細(xì)胞到損傷的心肌中，用足量的具有收縮功能的細(xì)胞恢復(fù)和改善病變區(qū)域心肌的功能。目前在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中有多種細(xì)胞被用來(lái)進(jìn)行心肌細(xì)胞成形術(shù)，如胚胎心肌細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞、成肌細(xì)胞(即骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞)及骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞等被陸續(xù)用來(lái)做細(xì)胞移植治療研究。來(lái)源于自身的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(marrow mesenchymal st

3、em cells，MSCs)可在體外大量擴(kuò)增，且具有多向分化潛能，能在適當(dāng)?shù)奈h(huán)境中，分化為骨、軟骨、脂肪、肝、神經(jīng)、內(nèi)皮、平滑肌、骨骼肌細(xì)胞和心肌樣細(xì)胞。MSCs 的應(yīng)用由于沒(méi)有醫(yī)學(xué)倫理和免疫排斥等問(wèn)題，目前是研究得較多的進(jìn)行細(xì)胞移植以治療缺血性心肌病的供體細(xì)胞。 胚胎畸瘤細(xì)胞(embryonal carcinoma cells， EC) 細(xì)胞與胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells， ES)在分化潛能、超微結(jié)構(gòu)

4、、細(xì)胞表面抗原和生化特性等方面具有相似性，同時(shí)與ES細(xì)胞相比，EC 細(xì)胞在無(wú)需飼養(yǎng)層和白細(xì)胞抑制因子(leukemia inhibitory factory，LIF)條件下培養(yǎng)即可保持未分化狀態(tài)，更易于培養(yǎng)，且易于進(jìn)行基因操作，而且通過(guò)分化培養(yǎng)過(guò)程EC細(xì)胞可從惡性表型轉(zhuǎn)化為非惡性表型，因此EC細(xì)胞的研究應(yīng)用日益受到廣大研究者的青睞。P19EC細(xì)胞系是McBumey等從C3H/He小鼠畸胎瘤中分離得到的具有多向分化潛能的胚胎性干細(xì)胞，其在

5、體外培養(yǎng)中單層生長(zhǎng)無(wú)需飼養(yǎng)層即可迅速大量擴(kuò)增，經(jīng)多次傳代仍保持胚胎干細(xì)胞特有標(biāo)記，如表面糖蛋白SSEA-1 及轉(zhuǎn)錄因子Oct-3 等。在體外，通過(guò)條件培養(yǎng)P19 細(xì)胞被誘導(dǎo)為包括心肌細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞、神經(jīng)元等多種類型的細(xì)胞，且分化過(guò)程類似于胚胎細(xì)胞的早期分化。因此P19細(xì)胞常被作為研究細(xì)胞早期發(fā)育的體外模型系統(tǒng)。P19 細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化過(guò)程中，其發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)及電生理學(xué)特征基本模擬了正常小鼠心肌發(fā)育過(guò)程，被認(rèn)為是研究心肌細(xì)胞發(fā)育的

6、良好體外模型系統(tǒng)，其向心肌細(xì)胞的分化過(guò)程日益引起人們的關(guān)注。本課題擬通過(guò)應(yīng)用不同方法、不同化學(xué)試劑體外誘導(dǎo)MSCs和P19細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化，觀察其分化過(guò)程中的形態(tài)學(xué)變化、心肌細(xì)胞早期轉(zhuǎn)錄因子及特異基因的表達(dá)，研究其生物學(xué)特性，摸索適宜骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和P19細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化的誘導(dǎo)方法，提高心肌細(xì)胞分化率，為建立高度標(biāo)準(zhǔn)化和最適宜的培養(yǎng)條件奠定基礎(chǔ)；為大規(guī)模篩選心肌化干細(xì)胞的研究奠定基礎(chǔ)；將膠體金標(biāo)記的MSCs移植到SD大鼠冠脈結(jié)扎心

7、梗模型的心肌組織中，觀察移植細(xì)胞的生長(zhǎng)分化情況和其在治療心梗中的作用，探討其作為進(jìn)行細(xì)胞移植的供體細(xì)胞來(lái)治療缺血性心肌病的可行性。 本實(shí)驗(yàn)共分三部分。 1 探討了大鼠MSCs的體外分離、純化、擴(kuò)增和向心肌細(xì)胞的定向誘導(dǎo)分化條件 利用貼壁培養(yǎng)的方法從成年SD大鼠股骨和脛骨骨髓中分離純化MSCs。MSCs培養(yǎng)于由IMDM培養(yǎng)液，10％特等優(yōu)質(zhì)胎牛血清、1％L-谷氨酰胺和青霉素100 ug/ml、鏈霉素100μg/ml

8、 組成的完全培養(yǎng)基，首次于接種后24h換液，以后每3d換一次液。在相差顯微鏡下觀察到：接種到培養(yǎng)瓶的原代細(xì)胞于接種后4小時(shí)開(kāi)始貼壁，24 小時(shí)后明顯貼壁，3-5天后逐漸融合成片，細(xì)胞融合達(dá)80％-90％；原代培養(yǎng)的細(xì)胞較混雜，MSCs的形態(tài)大部分為梭形的成纖維細(xì)胞狀，扁平狀的細(xì)胞為其他基質(zhì)細(xì)胞；隨著換液次數(shù)的增加，懸浮的造血細(xì)胞逐漸減少，梭形的成纖維細(xì)胞狀細(xì)胞逐漸增多。 2 骨形態(tài)蛋白 2 和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子對(duì)P19 細(xì)胞

9、向心肌細(xì)胞分化的影響 將P19細(xì)胞接種于鋪有0.5％軟瓊脂的培養(yǎng)皿中，分別用含0.2 ng/mLBMP-2和1.0 ng/mL FGF-2的分化培養(yǎng)基培養(yǎng)P19細(xì)胞，24h后即可見(jiàn)多個(gè)懸浮的細(xì)胞團(tuán)形成。細(xì)胞團(tuán)呈球形，形狀較規(guī)則，直徑隨時(shí)間延長(zhǎng)不斷增大，至第4天形成細(xì)胞聚集體/EBs。將細(xì)胞聚集體/EBs 接種于預(yù)置有蓋玻片的24孔培養(yǎng)板中，用不含BMP-2和FGF-2 的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。 3 觀察大鼠MSCs同種異體移植