人骨髓間充質(zhì)干細胞體外的分離培養(yǎng)及在血管緊張素Ⅱ誘導下向心肌樣細胞分化的研究.pdf

1、目的： 心肌細胞丟失、瘢痕形成及心室重構是造成心臟功能惡化的主要因素，也是最終導致慢性充血性心力衰竭的主要病理基礎。細胞移植治療是治療心臟疾病的一種新策略。骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)目前被認為是細胞移植治療最理想的種子細胞。研究BMSCs體外定向分化為心肌樣細胞對細胞移植治療心臟疾病具有重要的理論和臨床意義。 本課題旨在通過血管緊張素II化學誘導等方法體外誘導BMSCs定向分化，檢測BMSCs是否可分化為心肌樣細胞，

2、觀察血管緊張素II對BMSCs生長增殖的影響，對BMSCs分化的可能機制作一探討。本研究以人骨髓間充質(zhì)干細胞為研究對象，實驗分為兩部分，第一、體外分離、純化、傳代人骨髓間充質(zhì)干細胞(HBMMSc)。第二、血管緊張素II體外對HBMMSc向心肌樣細胞的誘導分化的研究。 方法： 1.HBMMSc的分離，培養(yǎng)和傳代及鑒定標本來源于正常人的骨髓。采用淋巴細胞分離液行密度梯度離心法分離骨髓單個核細胞，再利用貼壁篩選法純化骨髓間充質(zhì)

3、干細胞后，進行原代和傳代培養(yǎng)，并對其進行細胞生長和形態(tài)學的觀察、表面抗原的鑒定。 2.HBMMScs在血管緊張素II的誘導下向心肌細胞的培養(yǎng)分化及心肌細胞的鑒定。收集第8代hBMMSCs，分4組為實驗組3組和空白對照組。用0.1 μ mol/L Ang II誘導孵育hBMMSCs 24h。通過倒置顯微鏡形態(tài)學觀察、半定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)法鑒定誘導細胞是否具備心肌樣細胞的形態(tài)、結(jié)構特點及是否表達心肌特異性蛋白c

4、TnI，GATA-4，Nkx2.5。 結(jié)果： 1.hBMMScs原代培養(yǎng)接種24h貼壁完成，2-3天細胞呈梭形，第9天形成多個克隆，第14-16天細胞融合成單層，梭形突起變長，排列有明顯方向性，細胞排列成漩渦狀。傳代細胞24h內(nèi)完全貼壁，伸展成梭形，開始迅速增殖，7天即鋪滿培養(yǎng)瓶底，傳代細胞保持原代細胞的形態(tài)特征。隨代數(shù)增加，細胞得到純化，梭形細胞達95％以上。連續(xù)傳代至P8，細胞由梭形變?yōu)槠教?、寬大，分裂相減少，細胞質(zhì)

5、疏松，可見空泡。傳至P10，部分細胞變成圓形，折光增強，脫壁死亡。隨著傳代次數(shù)的增加，克隆形成率逐漸下降，10代后無明顯克隆出現(xiàn)。流式細胞測定分離提純后的hBMMScs表達CD29和CD44，不表達CD34和CD45。 2.Ang II誘導的細胞第8-10d即呈棒狀，第18-21d細胞為長桿狀，走向便趨一致。電泳檢測證實.AngII誘導的細胞第2、3、4、5周已經(jīng)表達cTnI，NkKX2.5，GATA-4，并且隨時間推移，蛋白表