高遷移率族蛋白B1在肝纖維化發(fā)生發(fā)展中的作用及其機(jī)制的研究.pdf

1、目的：
　　 通過觀察高遷移率族蛋白B1（High mobility group box protein 1，HMGB1)對(duì)肝星狀細(xì)胞（Hepatic stellate cell，HSC）的激活，以及RAGE在其激活過程中的作用，探討HMGB1對(duì)HSC的激活作用及其相關(guān)機(jī)制，為肝硬化的防治提供思路和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法：
　　 第一部分實(shí)驗(yàn)：HSC 復(fù)蘇后，加DMEM 培養(yǎng)液于37 ℃、5％CO 孵箱中培養(yǎng)，待

2、鋪滿80％后用0.25％胰酶消化，傳代2次至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期用于實(shí)驗(yàn)。調(diào)整細(xì)胞濃度為2～5×10/ml，轉(zhuǎn)至6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔1ml 培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)，25細(xì)胞單層融合達(dá)80％后，換無血清的DMEM培養(yǎng)液孵育2h，使培養(yǎng)細(xì)胞均處于G 期用于實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為三組：第一組：對(duì)照組（DMEM培養(yǎng)液10ml）；第二組：HMGB1刺激組（HMGB10.1ug/ml）；第三組：HMGB1抗體組（加HMGB1抗體20ug/ml 培養(yǎng)2小時(shí)后+HMGB10.

3、1ug/ml）。培養(yǎng)24小時(shí)后，采用免疫組化法檢測(cè)HSC的α-SMA和TGF-β1的表達(dá)，ELISA 法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中HA、PIIIP、CIV和TGF-β1的含量。
　　 第二部分實(shí)驗(yàn)：復(fù)蘇后的HSC 置于DMEM 培養(yǎng)液中，放在37 ℃、5％CO 孵箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合80％后，以0.25％胰蛋白酶消化傳代，以傳至第二代的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為三組：第一組：(A)對(duì)照組（DMEM 培養(yǎng)液12ml）；(B)HMGB1刺激組

4、（HMGB10.1ug/ml）；抗RAGE+HMGBl組（加RAGE抗體20ug/ml 2小時(shí)后＋HMGB10.1ug/ml）；第二組：(A)對(duì)照組（DMEM 培養(yǎng)液1ml）；(B)HMGB1刺激組（HMGB10.1ug/ml）；?sRAGE+HMGBl組（sRAGE 20ug/ml和HMGB10.1ug/ml 混合2小時(shí)后加入細(xì)胞DMEM 培養(yǎng)液中）；第三組：(A)對(duì)照組（DMEM 培養(yǎng)液1ml）；(B)HMGB1刺激組（HMGB10

5、.1ug/ml）；?AGE+HMGB1組（加AGE160ug/ml 2小時(shí)后＋HMGB10.1ug/ml）。培養(yǎng)24小時(shí)后，采用免疫組化法檢測(cè)HSC中α-SMA和TGF-β1的表達(dá)，ELISA 檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中HA、PIIIP、CIV和TGF-β1含量。
　　 結(jié)果：
　　 1.HMGB1對(duì)HSC 有顯著的激活作用：免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示，對(duì)照組HSC 未刺激時(shí)α-SMA、TGF-β1在細(xì)胞質(zhì)中微弱表達(dá)；HMGBl 刺

6、激24h后α-SMA、TGF-β1較對(duì)照組表達(dá)明顯增加(P＜0.05)；加入HMGB1抗體后，α-SMA、TGF-β1在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)水平與對(duì)照組比較無顯著差別(P＞0.05)，但較HMGB1組比較顯著下降(P＜0.05)。未刺激時(shí)，細(xì)胞培養(yǎng)上清液中HA，PIIIP，CIV和 TGF-β1含量較少；HMGBl 刺激24h后HA、PIIIP、CIV和TGF-β1含量均較對(duì)照組明顯增加(P＜0.05)；加入HMGB1抗體后，HA、PIIIP、

7、CIV和TGF-β1含量與對(duì)照組無顯著差別(P＞0.05)，但較HMGB1組明顯下降(P＜0.05)。
　　 2.RAGE抗體能抑制HMGB1對(duì)HSC的激活作用：免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示，在抗RAGE+HMGBl組，HSC細(xì)胞質(zhì)中的α-SMA、TGF-β1表達(dá)水平較HMGB1組明顯減少(P＜0.05)；ELISA 結(jié)果顯示，抗RAGE+HMGBl組培養(yǎng)液中的HA、PIIIP、CIV和TGF-β1含量較HMGB1組顯著下降(P＜0.0

8、5)；抗RAGE+HMGBl組的免疫細(xì)胞化學(xué)和ELISA 結(jié)果雖均較對(duì)照組有所增高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 3.sRAGE 可拮抗HMGB1對(duì)HSC的激活作用：免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示，在sRAGE+HMGBl組，HSC細(xì)胞質(zhì)中α-SMA、TGF-β1表達(dá)水平較HMGB1組明顯減少(P＜0.05)；ELISA 結(jié)果顯示，sRAGE+HMGBl組培養(yǎng)液中的HA、PIIIP、CIV和TGF-β1含量較HMGB1組顯著

9、下降(P＜0.05)，sRAGE+HMGBl組的免疫細(xì)胞化學(xué)和ELISA 結(jié)果雖均較對(duì)照組有所增高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 4.AGE 無阻斷HMGB1對(duì)HSC的激活作用：免疫組化結(jié)果顯示，在AGE+HMGB1組HSC細(xì)胞質(zhì)中的α-SMA、TGF-β1表達(dá)較HMGB1組比較有所增加，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；
　　 ELISA 結(jié)果顯示，AGE+HMGB1組培養(yǎng)液中的HA、PIIIP、CIV

10、和 TGF-β1含量較HMGB1組比較有所增加，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。AGE+HMGBl組的免疫組化和ELISA 結(jié)果與對(duì)照組比，表達(dá)水平均明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1.HMGB1可促進(jìn)α-SMA、TGF-β1在HSC細(xì)胞質(zhì)中的表達(dá)，增加HA、PIIIP、CIV和TGF-β1的分泌，在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用；
　　 2.RAGE抗體和sRAGE能抑制