高遷移率族蛋白B1影響小鼠調(diào)節(jié)性T細(xì)胞免疫功能的受體機(jī)制研究.pdf

1、目的：通過體外實驗觀察高遷移率族蛋白B1(high mobility group box-1protein，HMGB1)刺激對調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cell，Treg)免疫活性相關(guān)指標(biāo)表達(dá)水平的影響，初步探討HMGB1影響CD4+CD25+Treg免疫功能的可能受體機(jī)制；采用不同基因型動物進(jìn)行體內(nèi)實驗，進(jìn)一步明確HMGB1影響CD4+CD25+Treg免疫功能是否通過Toll樣受體起作用。 方法： ①采

2、用免疫磁珠法分離獲取正常C3H/HeN(Toll樣受體4野生型)小鼠脾臟CD4+CD25+Treg，鑒定細(xì)胞純度，調(diào)整細(xì)胞濃度1×106/孔后置于含10％小牛血清的1640培養(yǎng)液的96孔培養(yǎng)板。 ②將CD4+CD25+Treg隨機(jī)分4組，依HMGB1(100ng/ml)刺激時間不同設(shè)為對照組、24 h組、48 h組、72h組，觀察HMGB1刺激與Toll樣受體4(TLR4)表達(dá)的時間-效應(yīng)關(guān)系；依HMGB1刺激劑量的不同設(shè)為0n

3、g/ml組(對照組)、10ng/ml組、100ng/ml組、1000ng/ml組，作用48小時后用流式細(xì)胞儀分析CD4+CD25+Treg TLR4的表達(dá)情況(劑量．效應(yīng)關(guān)系)，同時分別留取細(xì)胞培養(yǎng)上清，ELISA法測定IL-10的變化情況。 ③以功能純化級抗-TLR4抗體(濃度2/μg/106cell)預(yù)封閉C3H/HeN小鼠CD4+CD25+Treg，觀察HMGB1刺激對CD4+CD25+Treg表達(dá)T淋巴細(xì)胞毒性相關(guān)抗原4

4、(cytotoxic T lymphocyte-associated antigen4，CTLA-4)及又頭翼狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子(forkhead/winged helix transcription factor，F(xiàn)oxp3)水平的影響。分組情況：時間-效應(yīng)關(guān)系實驗中，設(shè)正常對照組、24h組、48h組和72h組；劑量-效應(yīng)關(guān)系實驗中，設(shè)空白對照組、10ng/ml組、100ng/ml組和1000ng/ml組。收獲細(xì)胞時留取細(xì)胞培養(yǎng)上清，EL

5、ISA法測定上清中IL-10濃度的變化．情況。 ④將HMGB1以10μg/只、20μg/只的劑量分別腹腔注射C3H/HeN(TLR4野生型)小鼠和C3H/HeJ(TLR4突變型)小鼠體內(nèi)，48h后提取兩種小鼠脾臟CD4+CD25+Treg，繼續(xù)體外培養(yǎng)12h，收獲該細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測CTLA-4及Foxp3的表達(dá)情況，同時留取細(xì)胞培養(yǎng)上清，ELISA法測定上清IL-10的變化情況。 結(jié)果： 1．小鼠CD4+CD

6、25+Treg純度分析：多次分選細(xì)胞實驗證實，正常小鼠脾臟單個核細(xì)胞經(jīng)過MACS兩次分選后，CD4+CD25+Treg純度可達(dá)到91％以上。所獲得的CD4+CD25+Treg經(jīng)臺盼藍(lán)檢測活性大于97％。 2．HMGB1刺激可誘導(dǎo)CD4+CD25+Treg TLR4表達(dá)水平明顯下調(diào)(P＜0.05或P＜0.01)，其中，在劑量-效應(yīng)關(guān)系的實驗中(HMGB1刺激時間為48小時)，100ng/ml和1000ng/ml組TLR4分子表達(dá)水

7、平的下調(diào)程度顯著大于10ng/ml組(P＜0.05或P＜0.01)，而100ng/ml組與1000ng/ml組之間TLR4表達(dá)水平?jīng)]有統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)；在時間-效應(yīng)關(guān)系的實驗中(HMGB1刺激濃度為100ng/ml)，觀察到24h、48h和72h時間點(diǎn)TLR4分子的表達(dá)水平均呈現(xiàn)顯著下降趨勢，但各時間點(diǎn)的表達(dá)水平無明顯差異(P＞0.05)。 3．HMGB1(100 ng/ml)刺激CD4+CD25+Treg，CTLA-

8、4和Foxp3在24h、48h和72h表達(dá)水平較正常對照組均顯著下降(P＜0.01)，以48h和72h組下降尤為明顯；不同劑量HMGB1刺激CD4+CD25+Treg48h其CTLA-4和Foxp3表達(dá)水平亦顯著下調(diào)(P＜0.01)，其中以100 ng/ml和1000 ng/ml組降低幅度尤為明顯。經(jīng)封閉TLR4預(yù)處理后，給予HMGB1(100 ng/ml)刺激24h、48h和72h CD4+CD25+Treg表達(dá)CTLA-4和Foxp

9、3的水平均較對正常照組顯著增強(qiáng)(P＜0.05或P＜0.01)；而不同劑量HMGB1刺激CD4+CD25+Treg48h，僅以100 ng/ml組能顯著上調(diào)CTLA-4和Foxp3的表達(dá)水平(P＜0.01)。 4．體內(nèi)實驗中，兩種小鼠Treg細(xì)胞表達(dá)CTLA-4和Foxp3的基礎(chǔ)水平?jīng)]有明顯差異(P＞0.05)；而腹腔注射HMGB1后，兩種小鼠CD4+CD25+Treg CTLA-4扣Foxp3的表達(dá)水平存在顯著性差異，其中C3H

10、/HeN小鼠CD4+CD25+Treg表達(dá)CTLA-4和Foxp3水平較對照組水平顯降低，以20μg劑量刺激時降低的最明顯(P＜0.01)；C3H/HeJ小鼠CD4+CD25+Treg CTLA-4和Foxp3的表達(dá)水平較對照組水平顯著上調(diào)(P＜0.01)，以10μg刺激時表達(dá)水平上調(diào)的最為明顯(P＜0.01)。 結(jié)論： 1．免疫磁珠法分離所得的CD4+CD25+Treg細(xì)胞純度高，細(xì)胞活力未受明顯影響，完全可以滿足進(jìn)一

11、步實驗的要求。 2．HMGB1刺激CD4+CD25+Treg可下調(diào)TLR4的表達(dá)水平，提示TLR4可能參與調(diào)節(jié)CD4+CD25+Treg免疫活性的過程。 3．通過對TLR4進(jìn)行抗體封閉處理前后CD4+CD25+Treg免疫活性變化情況的比較發(fā)現(xiàn)，TLR4在HMGB1介導(dǎo)CD4+CD25+Treg免疫反應(yīng)過程中具有負(fù)向調(diào)控CD4+CD25+Treg免疫活性的作用。 4．HMGB1刺激可引起TLR4野生型和突變型小鼠