肝纖維化通過抑制高遷移率族蛋白B1的核外移位發(fā)揮損傷保護(hù)作用的研究.pdf

1、本實驗研究內(nèi)容共分四部分:
　　第一部分 四氯化碳誘導(dǎo)的肝纖維化能夠保護(hù)小鼠抵抗D-氨基半乳糖/脂多糖誘導(dǎo)的肝損傷
　　目的:
　　動態(tài)觀察CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化以及肝纖維化自發(fā)逆轉(zhuǎn)不同時間點的小鼠對致死劑量的D-GalN/LPS誘導(dǎo)的急性肝損傷的耐受性。
　　方法:
　　1.CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠模型的建立:給予Balb/c和C57BL/6J小鼠腹腔注射CCl4誘導(dǎo)肝纖維化模型，每周2次，共6w。Ma

2、sson染色和α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)免疫熒光染色檢驗肝纖維化模型是否誘導(dǎo)成功。
　　2.急性損傷:分別給正常小鼠和肝纖維化6w的小鼠腹腔注射D-GalN(1mg/g)/LPS(50 ng/g)建立急性損傷的小鼠模型，分4組:正常對照組(cont)、正常對照+急性損傷組(cont+D-GalN/LPS)、肝纖維化6w組(Fib)、肝纖維化6w+急性損傷組(Fib+D-GalN/LPS)，每組4-6只小鼠。血清及肝組織樣本均

3、在急性損傷后24h收集。
　　3.觀察急性損傷前后4組小鼠血清谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase，AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）的水平以及肝組織病理學(xué)的改變，比較正常對照組和肝纖維化6w組小鼠對致死劑量的D-GalN/LPS誘導(dǎo)的急性肝損傷的耐受性。
　　結(jié)果:
　　1.Masson染色和α-SMA免疫熒光染色提示肝纖維化小鼠模型誘導(dǎo)成功。

4、肝纖維化自發(fā)逆轉(zhuǎn)不同時間點的小鼠，按照R3d、R9d至R15d的順序，Masson染色和Ⅰ型膠原蛋白免疫熒光染色顯示膠原纖維逐漸減少，肝臟結(jié)構(gòu)逐漸恢復(fù)正常。
　　2.正常對照組小鼠經(jīng)腹腔注射D-GalN/LPS后，血清ALT、AST水平均明顯升高，而肝纖維化6w組小鼠血清ALT、AST水平升高卻并不明顯，且正常對照組小鼠給予急性損傷后血清轉(zhuǎn)氨酶水平明顯高于給予同樣損傷的肝纖維化6w組小鼠(cont vs cont+D-GalN/L

5、PS, cont+D-GalN/LPSvs Fib+D-GalN/LPS,P＜0.01)(Fibo vsFib+D-GalN/LPS，P＞0.05)。肝組織病理學(xué)顯示:正常對照組及肝纖維化6w組小鼠給予D-GalN/LPS損傷后均出現(xiàn)一定程度的肝細(xì)胞變性、壞死及炎細(xì)胞浸潤。然而，肝纖維化6w組小鼠給予急性損傷后肝細(xì)胞變性、壞死程度和給予同樣打擊的正常對照組小鼠比較明顯減輕，浸潤的炎細(xì)胞也明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(cont+D-GalN

6、/LPS vs Fib+ D-GalN/LPS，P＜0.05)。
　　3.分別給予肝纖維化自發(fā)逆轉(zhuǎn)不同時間點的小鼠注射D-GalN/LPS后，發(fā)現(xiàn)按照R3d，R9d至R15d的順序，血清ALT水平逐漸升高，肝細(xì)胞壞死程度逐漸加重，浸潤的炎細(xì)胞也增多，提示肝臟損傷程度逐漸加重。因此，隨著肝纖維化自發(fā)逆轉(zhuǎn)的向前推進(jìn)，肝纖維化基礎(chǔ)上的損傷保護(hù)作用逐漸減弱至消失。
　　第二部分 肝纖維化小鼠給予D-氨基半乳糖/脂多糖損傷后肝細(xì)胞內(nèi)H

7、MGB1的核外移位和細(xì)胞外釋放被抑制
　　目的:
　　分析HMGB1在肝細(xì)胞內(nèi)的分布位置和肝纖維化損傷保護(hù)作用的相關(guān)性，初步探索肝纖維化損傷保護(hù)作用的分子機(jī)制。
　　方法:
　　1.ELISA方法比較正常對照組、肝纖維化6w組以及肝纖維化自發(fā)逆轉(zhuǎn)不同時間點R3d，R9d，R15d的小鼠給予致死劑量的D-GalN/LPS攻擊后血清內(nèi)HMGB1的水平。
　　2.免疫組織化學(xué)方法觀察正常對照組、肝纖維化6w組以及

8、肝纖維化自發(fā)逆轉(zhuǎn)不同時間點R3d，R9d，R15d的小鼠給予致死劑量的D-GalN/LPS損傷后肝細(xì)胞內(nèi)HMGB1的表達(dá)和核外移位現(xiàn)象。
　　3.RT-PCR方法比較正常對照組、肝纖維化6w組以及肝纖維化自發(fā)逆轉(zhuǎn)不同時間點R3d，R9d，R15d的小鼠給予致死劑量的D-GalN/LPS損傷后肝組織內(nèi)HMGB1介導(dǎo)的炎癥因子IL-12，IL-6，TNF-α基因mRNA的表達(dá)水平，并同時檢測了肝組織中NF-κB（HMGB1和受體結(jié)合后

9、能激活NF-κB，激活的NF-κB又能促進(jìn)以上炎癥因子的釋放）和HMGB1基因mRNA的表達(dá)水平。
　　結(jié)果:
　　1.正常對照組、R9d、R15d的小鼠分別給予致死劑量的D-GalN/LPS損傷后，血清內(nèi)HMGB1的水平和損傷前相比明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均p＜0.05)。而肝纖維化6w組和R3d的小鼠給予同等劑量的D-GalN/LPS損傷后，血清內(nèi)HMGB1的水平和損傷前相比變化卻并不明顯，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均p＞0

10、.05)。
　　2.正常對照組、R9d、R15d的小鼠分別給予D-GalN/LPS攻擊后，肝細(xì)胞中HMGB1發(fā)生了明顯的核外移位和細(xì)胞外釋放。而肝纖維化6w組及R3d的小鼠給予同樣刺激后，并未發(fā)生這種現(xiàn)象，多數(shù)肝細(xì)胞內(nèi)HMGB1仍然分布于細(xì)胞核，只有少數(shù)幾個肝細(xì)胞中發(fā)生了HMGB1的核外移位。
　　3.正常對照組、R9d、R15d的小鼠分別給予D-GalN/LPS損傷后，肝組織內(nèi)IL-12，IL-6，TNF-α，NF-κB和

11、HMGB1基因mRNA的表達(dá)水平和損傷前相比明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均p＜0.05）。而肝纖維化6w組及R3d的小鼠給予同樣刺激后，肝組織內(nèi)IL-12，IL-6，TNF-α，NF-κB和HMGB1基因mRNA的表達(dá)水平和損傷前相比變化不大（均p＞0.05）。
　　第三部分 纖維化肝臟中M2型枯否細(xì)胞給予LPS或HMGB1肽刺激后HMGB1的核外移位被抑制
　　目的:
　　研究纖維化肝臟中KCs的活化類型以及其活化類

12、型對HMGB1核外移位的影響，初步探索KCs的活化類型以及HMGB1在細(xì)胞內(nèi)的分布位置和肝纖維化損傷保護(hù)作用的相關(guān)性。
　　方法:
　　1.從正常對照組小鼠，正常小鼠給予注射D-GalN/LPS造成的急性損傷組以及肝纖維化6w組小鼠的肝臟中分離并體外培養(yǎng)KCs。
　　2.采用RT-PCR方法鑒定以上3組小鼠肝臟中分離出來的KCs的活化類型。
　　3.從正常對照組，肝纖維化6w組小鼠肝臟中分離出的KCs均給予LPS

13、或HMGB1肽作用，20h后采用免疫熒光染色方法觀察以上2種KCs中HMGB1的核外移位情況。
　　結(jié)果:
　　1.從肝纖維化6w組小鼠肝臟中分離出來的KCs主要以M2型為主。從正常小鼠注射D-GalN/LPS造成的急性損傷組中分離出來的KCs主要以M1型為主。
　　2.正常對照組小鼠分離出來的KCs中，LPS或HMGB1肽能促進(jìn)HMGB1的核外移位。從肝纖維化6w小鼠肝臟中分離出來的KCs中，HMGB1多位于細(xì)胞核內(nèi)

14、，既使給予LPS或HMGB1肽刺激，仍未發(fā)現(xiàn)HMGB1的核外移位。
　　第四部分 HMGB1通過TLR4途徑促進(jìn)D-GalN/TNF-α誘導(dǎo)的小鼠肝細(xì)胞的凋亡
　　目的:
　　觀察HMGB1在D-GalN/TNF-α誘導(dǎo)的小鼠肝細(xì)胞系A(chǔ)ML-12細(xì)胞凋亡過程中的作用，并探索其可能的信號通路。
　　方法:
　　1.給予HMGB1肽預(yù)處理小鼠AML-12細(xì)胞，然后采用TNF-α/D-GalN誘導(dǎo)AML-12細(xì)胞

15、凋亡，AnnexinⅤ-FITC/PI流式細(xì)胞術(shù)檢測HMGB1肽對AML-12細(xì)胞凋亡率的影響。
　　2.給予TLR4抗體預(yù)處理小鼠AML-12細(xì)胞，然后采用TNF-α/D-GalN誘導(dǎo)AML-12細(xì)胞凋亡，AnnexinⅤ-FITC/PI流式細(xì)胞術(shù)檢測TLR4抗體對AML-12細(xì)胞凋亡率的影響。采用RT-PCR方法測定誘導(dǎo)凋亡后小鼠肝細(xì)胞中Bax、Bcl-2、NF-κB、TLR4、HMGB1基因mRNA的水平。采用western

16、 blot方法測定誘導(dǎo)凋亡后小鼠肝細(xì)胞中Bax、Bcl-2、NF-κB、TLR4、HMGB1蛋白的水平。
　　結(jié)果:
　　1.HMGB1肽能促進(jìn)TNF-α/D-GalN誘導(dǎo)的AML-12細(xì)胞的凋亡。HMGB1肽預(yù)處理細(xì)胞并誘導(dǎo)凋亡后，細(xì)胞凋亡率升高。
　　2.TLR4抗體能夠增加AML-12細(xì)胞對TNF-α/D-GalN誘導(dǎo)的凋亡的耐受性。TLR4抗體預(yù)處理細(xì)胞并誘導(dǎo)凋亡后，細(xì)胞凋亡率下降，細(xì)胞中Bax、NF-κB、T

17、LR4基因mRNA水平下調(diào)，Bcl-2、HMGB1基因mRNA水平上調(diào)。蛋白的表達(dá)水平和基因mRNA的變化一致。
　　結(jié)論:
　　1.CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化能夠保護(hù)小鼠抵抗致死劑量的D-GalN/LPS誘導(dǎo)的肝損傷，隨著肝纖維化自發(fā)逆轉(zhuǎn)的推進(jìn)，該損傷保護(hù)作用逐漸消失。
　　2.肝纖維化小鼠給予D-GalN/LPS誘導(dǎo)損傷后，肝細(xì)胞內(nèi)HMGB1的核外移位和細(xì)胞外釋放被抑制，并且伴隨肝組織內(nèi)HMGB1誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的減弱。