高遷移率族蛋白B-1對心臟成纖維細胞的作用及信號通路研究.pdf

1、前言:心肌重構是多種心血管疾病的發(fā)生基礎，如高血壓、缺血性心肌病等，是心力衰竭發(fā)生發(fā)展的決定性過程。心肌重構主要表現(xiàn)為心肌細胞肥大，間質纖維化及電重構過程。成年心臟中成纖維細胞的數(shù)目占60-70％，是細胞外基質(ECM)的主要來源，ECM在心臟中起維持心臟結構和功能完整的作用[1]。心臟成纖維細胞對損傷刺激反應表現(xiàn)為多種方式，如增殖、遷移、分化為肌成纖維細胞，分泌細胞因子，以及基質金屬蛋白酶(MMP)與組織金屬蛋白酶抑制劑(TIMP)表

2、達失衡[2]，這些反應在初始階段對心肌功能恢復有利，但長期持續(xù)將導致纖維化[3]。心臟中ECM的合成降解是精密調控的過程。MMPs是依賴鋅的蛋白酶家族，能降解多種ECM蛋白，包括膠原，明膠，纖維連接蛋白及層粘連蛋白[4]。基礎條件下，心臟成纖維細胞表達MMP-9的水平很低，但在炎癥因子刺激下顯著升高MMP-9[2]。炎癥因子起初誘導成纖維細胞聚集以利于心臟修復損傷，然而，若炎癥因子持續(xù)存在，他們將刺激纖維化，誘發(fā)心肌重構[5]。目前研究

3、報道有多種炎癥因子能誘導MMP與TIMP失衡，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α），白細胞介素-1β(IL-1β)，最終導致ECM紊亂[6，7]。炎癥因子在心血管疾病中的作用及其機制研究已得到越來越多的關注及重視?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，多種炎癥因子參與心肌重構過程，但其在不同病因誘導的心肌重構中發(fā)揮的作用不盡相同。高遷移率族蛋白B-1(HMGB1)是一種新發(fā)現(xiàn)的細胞因子，其廣泛表達于真核細胞的細胞核中，核內的HMGB1作為DNA結合蛋白充當結構輔助因子

4、，維持恰當?shù)霓D錄調節(jié)。而細胞外的HMGB1由免疫細胞主動分泌或壞死細胞被動釋放[8]。目前報道細胞外的HMGB1參與多種病理過程，如炎癥，動脈粥樣硬化，心肌缺血再灌注損傷（I/R）及心力衰竭等[9]。Andrassy[10]等人研究發(fā)現(xiàn)利用重組HMGB1干預小鼠會加重I/R，然而利用HMGB1 boxA干預后能顯著縮小梗死面積并能降低心臟損傷標志物。而且研究報道HMGB1能促進心肌細胞肥大，誘導心肌肥厚，并能下調心臟瞬時外向鉀電流，誘導

5、心臟電重構過程[11，12]。相反的是，近期研究提示HMGB1同時具有促進組織修復和再生的作用[8]。然而，HMGB1在心肌重構中的作用并未完全闡明，成纖維細胞在心肌重構中具有重要作用。因此本研究擬通過體外培養(yǎng)細胞，觀察HMGB1對心臟成纖維細胞是否具有直接的生物學作用，并進一步探討其相關機制，為心血管疾病提供潛在的治療靶點。本文主要從以下幾個方面進行了論述:
　　第一部分 高遷移率族蛋白B-1對心臟成纖維細胞增殖、遷移、分化的影

6、響。
　　目的:觀察不同濃度(0，10，100，1000ng/ml)的高遷移率族蛋白B-1(HMGB1)對新生大鼠成纖維細胞增殖、遷移、分化的影響。
　　方法:利用新生SD大鼠(1-2天)分離、培養(yǎng)心臟成纖維細胞，予以不同濃度HMGB1(0，10，100，1000ng/ml)刺激24小時，采用CCK-8檢測細胞活力，Cell-IQ檢測細胞增殖，細胞劃痕實驗及transwell實驗檢測細胞遷移能力，Westernblot檢測α

7、-SMA蛋白，檢測對細胞分化的影響。
　　結果:CCK-8提示任何濃度的HMGB1(0，10，100，1000ng/ml)對心臟成纖維細胞沒有細胞毒作用。Cell-IQ提示HMGB1(0，10，100，1000ng/ml)干預24小時后，各組間成纖維細胞的數(shù)目相似。劃痕實驗及transwell實驗均提示10ng/ml濃度的HMGB1明顯促進成纖維細胞遷移，而更高濃度的HMGB1(100，1000ng/ml)卻沒有促進成纖維細胞遷移

8、的作用。蛋白免疫印跡(Western blot)檢測提示α-SMA蛋白在不同濃度的HMGB1(0，10，100，1000ng/rnl)組間表達無顯著差異。
　　結論:任何濃度的HMGB1(0，10，100，1000ng/ml)對新生大鼠心臟成纖維細胞刺激24小時后，無細胞毒作用，無促進增殖作用及分化為肌成纖維細胞的作用。但是10ng/ml濃度的HMGB1明顯促進成纖維細胞遷移，然而更高濃度的HMGB1(100，1000ng/ml)

9、卻沒有促進成纖維細胞遷移的作用。
　　第二部分 高遷移率族蛋白B-1對心臟成纖維細胞MMP-9與TIMP-1表達的影響。
　　目的:觀察不同濃度(0，10，100，1000ng/ml)的高遷移率族蛋白B-1(HMGB1)對新生大鼠成纖維細胞MMP-9與TIMP-1表達的影響。
　　方法:利用新生SD大鼠(1-2天)分離、培養(yǎng)心臟成纖維細胞，予以不同濃度HMGB1(0，10，100，1000ng/ml)刺激24小時，提取

10、胞內總蛋白，采用蛋白免疫印跡(Western blot)檢測胞內MMP-9與TIMP-1蛋白表達水平;利用Millipore超濾管濃縮細胞上清，利用蛋白免疫印跡(Western blot)檢測細胞上清中MMP-9與TIMP-1蛋白水平。
　　結果:不同濃度的HMGB1(0，10，100，1000ng/ml)刺激新生大鼠心臟成纖維細胞24小時后，100ng/ml濃度的HMGB1干預組的細胞上清中MMP-9蛋白水平較對照組明顯升高(P

11、＜0.05)，然而更高濃度的HMGB1(1000ng/ml)刺激卻不能進一步升高細胞上清中的MMP-9蛋白水平。同時，10ng/ml和100ng/ml濃度的HMGB1刺激均能升高細胞上清中的TIMP-1蛋白水平(P＜0.05)。此外，不同濃度的HMGB1(0，10，100，1000ng/ml)對成纖維細胞胞內MMP-9及TIMP-1蛋白表達沒有顯著影響。
　　結論:HMGB1(10，100ng/ml)主要是通過上調胞外MMP-9及

12、TIMP-1蛋白誘導ECM紊亂的，然而對成纖維細胞胞內MMP-9及TIMP-1蛋白表達沒有顯著影響。100ng/ml是HMGB1顯著刺激成纖維細胞表達MMP-9及TIMP-1蛋白的最佳濃度。
　　第三部分 高遷移率族蛋白B-1對心臟成纖維細胞作用受體及MAPKs通路的影響。
　　目的:觀察100ng/ml濃度的高遷移率族蛋白B-1(HMGB1)對新生大鼠成纖維細胞RAGE與TLR4受體表達的影響，并探討其對MAPKs的活化情

13、況。
　　方法:利用新生SD大鼠（1-2天）分離、培養(yǎng)心臟成纖維細胞，予以100ng/ml濃度的HMGB1刺激24小時，提取胞內總蛋白，采用蛋白免疫印跡(Western blot)檢測RAGE與TLR蛋白表達水平。同時對成纖維細胞進行HMGB1(100ng/ml)刺激0分鐘，5分鐘，10分鐘，30分鐘，采用蛋白免疫印跡(Western blot)檢測MAPKs(p-ERK1/2，p-JNK，p-P38)表達變化。
　　結果:

14、100ng/ml濃度的HMGB1干預心臟成纖維細胞24小時，TLR4表達較對照組升高(P口＜0.05），而RAGE表達與對照組相比無顯著差異。100ng/ml濃度的HMGB1刺激成纖維細胞不同時間(0，5，10，30min)，心臟成纖維細胞ERK1/2的磷酸化水平增加，且在5分鐘p-ERK1/2的表達水平達到高峰(P＜0.05);然而100ng/ml濃度的HMGB1干預成纖維細胞不同時間(0，5，10，30min)后并不能誘導JNK及P

15、38顯著活化。
　　結論:100ng/ml濃度的HMGB1能上調成纖維細胞TLR4受體表達，并能特異性地活化ERK1/2，提示HMGB1可能主要通過TLR4受體活化ERK1/2的。
　　第四部分 ERK1/2在高遷移率族蛋白B-1調節(jié)MMP-9及TIMP-1表達中的作用。
　　目的:觀察PD98059預先阻斷ERK1/2后，100ng/ml濃度的高遷移率族蛋白B-1(HMGB1)刺激新生大鼠成纖維細胞后對MMP-9及T

16、IMP-1表達的改變。
　　方法:利用新生SD大鼠(1-2天)分離、培養(yǎng)心臟成纖維細胞，預先予以12.5uM濃度的PD98059阻斷ERK1/2，2小時后再予100ng/ml濃度的高遷移率族蛋白B-1(HMGB1)干預成纖維細胞24小時，提取胞內總蛋白，采用蛋白免疫印跡(Western blot)檢測胞內MMP-9與TIMP-1蛋白表達變化;利用Millipore超濾管濃縮細胞上清，利用蛋白免疫印跡(Western blot)檢測