高遷移率族蛋白B1在肝臟慢性炎癥與纖維化中的作用.pdf

1、研究背景：
　　 肝纖維化（Hepatic fibrosis）這一病理過程是各種慢性肝病進(jìn)展為肝硬化的共同途徑。肝纖維化最終發(fā)展為肝硬化和肝癌的比率甚高，高達(dá)25％～40％，而肝硬化的并發(fā)癥和肝癌的死亡率是嚴(yán)重危害人們健康的世界性問題。肝纖維化是一個具有可逆性的病理過程，因此，阻止肝纖維化的進(jìn)展是改善肝病預(yù)后的重要策略。目前研究認(rèn)為，慢性炎癥反應(yīng)是肝纖維化發(fā)生發(fā)展的重要因素。近期的研究表明，高遷移率族蛋白B1(High mobi

2、lity group protein box 1，HMGB1)作為典型的內(nèi)源性危險相關(guān)分子(Danger-associated molecular patterns，DAMPs)，在肝損傷引發(fā)的炎癥反應(yīng)中起著重要的作用。針對HMGB1在肝纖維化中作用的研究，引發(fā)了學(xué)者們極大的興趣。因此，我們旨在觀察HMGB1對肝臟慢性炎癥反應(yīng)和纖維化反應(yīng)的作用。
　　 目的：
　　 通過觀察高遷移率組蛋白1（High mobility

3、group box protein 1，HMGB1）對肝纖維化小鼠的相關(guān)炎癥因子和纖維化因子的影響，探討HMGB1在肝臟慢性炎癥和纖維化中的作用。
　　 方法：
　　 第一部分實(shí)驗：昆明雄性小鼠40只，采用CCL4灌胃法制備肝纖維化模型，隨機(jī)分為正常對照組（1ul/g生理鹽水灌胃，每5天一次）、2周模型組、4周模型組、6周模型組（1ul/gCCL4油溶液灌胃，每5天一次）。各組動物處理前12小時禁食，摘除眼球法取血，EL

4、ISA法檢測血清中透明質(zhì)酸(HA)、Ⅰ型膠原蛋白(Col-Ⅰ)、Ⅲ型前膠原蛋白（PⅢP）和腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白介素6(IL-6)的含量；分別對肝組織病理切片進(jìn)行HE染色和天狼猩紅染色；Western blot法檢測肝組織HMGB1的表達(dá)水平。
　　 第二部分實(shí)驗：昆明雄性小鼠20只，采用CCL4灌胃法制備肝纖維化模型，隨機(jī)分為模型組（1ul/gCCL4油溶液灌胃，每5天一次）、干預(yù)組（1ul/gCCL4油溶液灌胃,5

5、0ug/mouse HMGB1-Ab和5ug/g丙酮酸乙酯腹腔注射，每5天一次）。各組動物處理前12小時禁食，摘除眼球法取血，ELISA法檢測血清中HA、Col-Ⅰ、PⅢP和IL-6、TNF-α的含量；分別對肝組織病理切片進(jìn)行HE染色和天狼猩紅染色；半定量RT-PCR法檢測小鼠肝組織中TGF-β、α-SMA和MMP-9 mRNA的表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 1、建立小鼠肝纖維化模型。6周模型組病理切片顯示肝細(xì)胞變性壞死比

6、較嚴(yán)重，伴有炎癥細(xì)胞浸潤，并出現(xiàn)肝纖維組織增生；ELISA法檢測血清膠原蛋白含量結(jié)果顯示，正常對照組血清中HA、Col-Ⅰ、PⅢP含量較少；2周、4周、6周模型組血清中HA、Col-Ⅰ、PⅢP含量均較正常對照組明顯增加(P＜0.05)；6周模型組血清中HA、Col-Ⅰ、PⅢP含量均較4周模型組明顯增加(P＜0.05)。
　　 2、CCL4致肝纖維化模型IL-6、TNF-α和HMGB1的變化。ELISA法檢測正常對照組血清中IL-

7、6、TNF-α含量較少；2周、4周、6周模型組血清中IL-6、TNF-α含量均較對照組明顯增加(P＜0.05)；6周組血清中IL-6、TNF-α含量均較4周組明顯增加(P＜0.05)。Westem-blot結(jié)果表明正常對照組肝組織內(nèi)無HMGB1表達(dá)，肝纖維化過程中肝組織HMGB1的表達(dá)隨著CCL4損傷周期的延長而逐漸升高，與正常對照組比較，2周、4周、6周模型組的HMGBI表達(dá)量明顯增加，有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；與4周模型組比較，

8、6周HMGB1的表達(dá)量顯著增加(P＜0.05)。
　　 3、拮抗HMGB1可降低血清中IL-6、TNF-α的含量。ELISA法檢測各組動物血清中炎癥因子含量結(jié)果顯示，與模型組比較，干預(yù)組動物血清中IL-6、TNF-α的含量明顯減少(P＜0.05)。
　　 4、拮抗HMGB1可降低肝纖維化程度。HE染色顯示，模型組肝細(xì)胞彌漫性脂肪變性，中央靜脈周圍肝細(xì)胞灶狀壞死，炎癥細(xì)胞浸潤，匯管區(qū)周圍纖維化，纖維間隔形成。干預(yù)組肝細(xì)胞少

9、量的脂肪變性，炎癥細(xì)胞浸潤減少，匯管區(qū)有纖維產(chǎn)生，但無間隔形成。天狼猩紅染色結(jié)果顯示模型組肝組織內(nèi)膠原纖維向肝小葉延伸，并形成纖維間隔，與模型組相比較，干預(yù)組肝組織內(nèi)膠原纖維顯著下降(0.57％±0.21％vs1.02％±0.33％;P＜0.05)。ELISA法檢測各組動物血清中膠原蛋白含量結(jié)果顯示，與模型組比較，干預(yù)組動物血清中HA、Col-Ⅰ、PⅢP的含量明顯減少(P＜0.05)。RT-PCR結(jié)果顯示與模型組小鼠肝臟組織TGF-β、