高遷移率族蛋白B1對(duì)成骨細(xì)胞遷移和增殖的影響及其作用機(jī)制.pdf

1、目的：
　　1.研究HMGB1對(duì)大鼠成骨細(xì)胞增殖及遷移的影響:重組HMGB1對(duì)體外培養(yǎng)的大鼠成骨細(xì)胞增殖以及遷移能力的影響及規(guī)律。
　　2.研究HMGB1影響成骨細(xì)胞遷移的分子機(jī)制:通過(guò)利用小干擾RNA干擾技術(shù)研究toll樣受體2(TLR2)及toll樣受體4(TLR4)在成骨細(xì)胞遷移過(guò)程中的作用及對(duì)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子核因子-κB(NF-κB)的活化影響，確定其作用途徑和分子機(jī)制。
　　方法：
　　1.材料和試劑:SD

2、大鼠成骨細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)天津威凱生物公司;胎牛血清，胰酶及DMEM培養(yǎng)液;四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)和二甲基亞砜(DMSO);Trizol及Turbofect轉(zhuǎn)染試劑;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及PCR試劑盒;NE-PER胞核胞漿提取試劑盒;rhHMGB1;TLR2，TLR4，NF-κB p65及GAPDH的抗體。
　　2.細(xì)胞培養(yǎng):將成骨細(xì)胞以每孔2×105個(gè)接種于六孔板，用含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)于37℃，5％ CO2的孵箱中，每?jī)商?/p>

3、更換一次培養(yǎng)液，將細(xì)胞分為空白對(duì)照組，TLR2-siRNA轉(zhuǎn)染組和TLR4-siRNA轉(zhuǎn)染組。
　　3.TLR2及TLR4 siRNAs的設(shè)計(jì)及轉(zhuǎn)染:設(shè)計(jì)合成三對(duì)針對(duì)TLR2，TLR4的siRNA，以與人類基因無(wú)同源性的siRNA作為陰性對(duì)照（siRNA序列見(jiàn)正文）;將成骨細(xì)胞培養(yǎng)至70-80％融合時(shí)，吸去舊的培養(yǎng)基，用PBS輕洗2次，每孔加入1.6ml無(wú)血清培養(yǎng)基，置于5％ CO2、37℃培養(yǎng)箱中;取濃度為20μM的siRNA/

4、microRNA2μl,加入400μl無(wú)血清培養(yǎng)基中，混勻后，加入4μl TurbofectsiRNA轉(zhuǎn)染試劑，混勻后在室溫下孵育15-20min;每孔加入上述孵育好的轉(zhuǎn)染復(fù)合液400μl，置于5％ CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4-6h后換成正常的完全培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染后24-48h，檢測(cè)mRNA及蛋白表達(dá)水平。
　　4.RT-PCR: siRNA轉(zhuǎn)染24h后收集細(xì)胞，按照Trizol說(shuō)明書進(jìn)行細(xì)胞總RNA提取，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。后以c

5、DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增（引物序列見(jiàn)正文）。反應(yīng)條件為95℃10min;然后95℃15s，60℃30s，72℃15s，95℃15s，共40個(gè)循環(huán);然后60℃1min，95℃15s。繪制熔解曲線及標(biāo)準(zhǔn)曲線，以GAPDH為內(nèi)參，通過(guò)ΔΔCT方法分析基因的表達(dá)結(jié)果。至少重復(fù)進(jìn)行三次單獨(dú)的實(shí)驗(yàn)。
　　5.Western印跡法及蛋白細(xì)胞漿細(xì)胞核抽提技術(shù):siRNA轉(zhuǎn)染24h后收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，采用BCA法進(jìn)行蛋白定量;采用細(xì)胞核

6、及細(xì)胞漿提取試劑盒提取NF-κB p65胞核和胞漿蛋白，Lamin B1和GAPDH分別作為胞核和胞漿內(nèi)參，采用BCA法進(jìn)行蛋白定量。取等量蛋白40μg上樣，進(jìn)行10％十二烷基硫酸鈉-聚丙烯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，濃縮膠80V，分離膠120V恒壓電泳，350mA恒流轉(zhuǎn)膜1h。然后用5％脫脂奶粉的TBST液中封閉2h，加入抗TLR2，TLR4及GAPDH抗體4℃孵育過(guò)夜，次日室溫孵育1h后TBST洗膜10 min3次，用辣根過(guò)氧化

7、物酶標(biāo)記的多克隆山羊抗兔IgG孵育1h，TBST洗膜10 min3次，增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑(ECL)顯色，X膠片曝光，采集圖像。采用Uvipro凝膠成像系統(tǒng)掃描膠片，IPP6.0軟件分析光密度值，以目的蛋白和相應(yīng)內(nèi)參條帶的光密度比值表示目的蛋白的表達(dá)水平。
　　6.細(xì)胞增殖測(cè)定:采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況，取不同組成骨細(xì)胞按5×103個(gè)/mL接種至96孔板，每孔200μl，設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，置于37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1-3d，

8、在培養(yǎng)結(jié)束前4h每孔加入20μl MTT溶液，然后培養(yǎng)結(jié)束后棄去培養(yǎng)液，每孔加入150μl DMSO，震蕩10min，酶標(biāo)儀檢測(cè)492 nm處的吸光值。
　　7.細(xì)胞遷移測(cè)定:采用Boyden Transwell小室法(24孔微孔聚碳酸酯膜，孔直徑8.0μm，膜厚度6.5 mm)進(jìn)行細(xì)胞遷移檢測(cè)，將細(xì)胞密度調(diào)整為1×105個(gè)/mL經(jīng)不同處理后的成骨細(xì)胞100μl加入上室中，下室加入500μl含15％FBS的DMEM培養(yǎng)液，置于37

9、℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h后，棄去培養(yǎng)液，用棉簽擦去上室內(nèi)未遷移的細(xì)胞，95％酒精常溫固定30min，結(jié)晶紫染色20min，PBS清洗，在顯微鏡10倍視野下觀察，每一樣本隨機(jī)選取4-5個(gè)視野，計(jì)數(shù)每個(gè)視野下染色細(xì)胞數(shù)量，取其平均值。
　　統(tǒng)計(jì)分析：
　　應(yīng)用SPSS18.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)值變量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（M±SD）表示，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05被認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　

10、　結(jié)果：
　　1.HMGB1促進(jìn)成骨細(xì)胞遷移，同時(shí)不影響成骨細(xì)胞增殖
　　我們利用Boyden Transwell小室法檢測(cè)細(xì)胞的遷移能力，利用MTT法檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力。將細(xì)胞培養(yǎng)液中分別加入濃度為0，50，100，150，200μg/L的重組人HMGB1，進(jìn)行培養(yǎng)24h后，將各組細(xì)胞加入Transwell小室的上層中，進(jìn)行遷移實(shí)驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)遷移4h后，大量的成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)移到下層，通過(guò)計(jì)數(shù)發(fā)現(xiàn)HMGB1可促進(jìn)成骨細(xì)胞遷移，并

11、呈濃度依賴性，在濃度為150μg/l時(shí)細(xì)胞遷移能力最強(qiáng)，為對(duì)照組的2倍(p＜0.05)。選擇該濃度進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。MTT法顯示不同濃度HMGB1刺激下細(xì)胞的增殖能力無(wú)明顯改變。
　　2.siRNA轉(zhuǎn)染可有效抑制成骨細(xì)胞TLR2，TLR4的mRNA及蛋白表達(dá)水平
　　通過(guò)RT-PCR及Western印記法檢測(cè)轉(zhuǎn)染24h后成骨細(xì)胞TLR2，TLR4的mRNA及蛋白表達(dá)水平。結(jié)果表明3組針對(duì)TLR2及TLR4的siRNA都能有效沉

12、默相應(yīng)受體mRNA及蛋白的表達(dá)(p＜0.05);其中TLR2-siRNA392，TLR4-siRNA703組與空白對(duì)照組相比，TLR2及TLR4的mRNA表達(dá)水平分別下調(diào)了94％和84％，蛋白表達(dá)水平分別下調(diào)了52％和35％(p＜0.05)。因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)選用TLR2-siRNA392，TLR4-siRNA703進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染。
　　3.HMGB1通過(guò)TLR2或TLR4誘導(dǎo)成骨細(xì)胞NF-κB的活化
　　選擇沉默效率最高的TLR2

13、-siRNA392，TLR4-siRNA703進(jìn)行轉(zhuǎn)染后，將細(xì)胞分為3組，分別為對(duì)照組， TLR2-siRNA組， TLR4-siRNA組，通過(guò)胞漿胞核提取技術(shù)及Western印跡法檢測(cè)各組細(xì)胞在受到重組人HMGB1刺激前后細(xì)胞核內(nèi)外NF-κB p65的含量。當(dāng)對(duì)照組成骨細(xì)胞受到HMGB1刺激后，細(xì)胞核內(nèi)NF-κB p65明顯升高，但利用TLR2-siRNA及TLR4-siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，細(xì)胞TLR2及TLR4表達(dá)下降后，在同樣重組H

14、MGB1刺激下，細(xì)胞核內(nèi)NF-κB p65增加的含量較未轉(zhuǎn)染組降低，降至對(duì)照組的47％和75％(p＜0.05)。
　　4.HMGB1通過(guò)TLR2或TLR4誘導(dǎo)成骨細(xì)胞的遷移
　　選擇沉默效率最高的TLR2-siRNA392，TLR4-siRNA703轉(zhuǎn)染后，將細(xì)胞分為3組，分別為對(duì)照組，TLR2-siRNA組， TLR4-siRNA組，檢測(cè)各組細(xì)胞在受到重組人HMGB1刺激前后改變的遷移數(shù)量。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)對(duì)照組成骨細(xì)胞受到重組人

15、HMGB1（150μg/l）刺激后，細(xì)胞遷移能力增加了2倍(P＜0.05)，但TLR2-siRNA組及TLR4-siRNA組在相同濃度的HMGB1刺激下，增加的細(xì)胞遷移數(shù)量較對(duì)照組明顯降低(P＜0.01)。說(shuō)明TLR2/TLR4參與了HMGB1誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞遷移。
　　結(jié)論：
　　在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)重組人HMGB1可促進(jìn)大鼠成骨細(xì)胞遷移，大鼠成骨細(xì)胞在受到重組人HMGB1刺激后，通過(guò)Transwell實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞遷移能力較

16、對(duì)照組增加了2.3倍，MTT實(shí)驗(yàn)顯示細(xì)胞的增殖能力未受到明顯影響。成骨細(xì)胞可表達(dá)TLR2及TLR4，利用siRNA干擾技術(shù)，有效抑制了TLR2和TLR4mRNA的表達(dá)，抑制率分別達(dá)到了94％和84％，同時(shí)蛋白表達(dá)水平也受到了顯著的抑制，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)篩選TLR2，TLR4的siRNA具有高效性，高特異性，是一種選擇性沉默基因表達(dá)的有效工具。當(dāng)TLR2及TLR4受到siRNA抑制后，在相同濃度的HMGB1刺激下，細(xì)胞遷移能力的增加受到了明顯的

17、抑制，同時(shí)NF-κB細(xì)胞核內(nèi)活化能力下降，但是細(xì)胞增殖的變化未受到明顯影響。以上表明HMGB1可通過(guò)TLR2，TLR4及NF-κB促進(jìn)成骨細(xì)胞遷移，并不影響細(xì)胞的增殖能力。聯(lián)合文獻(xiàn)報(bào)道HMGB1可刺激骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的遷移，并可聯(lián)合其他炎性因子促進(jìn)破骨細(xì)胞的形成，可推測(cè)HMGB1在骨系統(tǒng)中可通過(guò)協(xié)調(diào)成骨系統(tǒng)和破骨系統(tǒng)的作用來(lái)完成骨損傷后的修復(fù)和軟骨內(nèi)成骨過(guò)程，本研究對(duì)HMGB1對(duì)成骨細(xì)胞的具體作用及相關(guān)可能機(jī)制提供了重要補(bǔ)充，首次顯示激