棕櫚酸增加FAT-CD36表達和棕櫚酰化修飾致HepG2細胞內脂質異常積聚.pdf

1、目的：隨著肥胖及其相關代謝綜合征全球化的流行趨勢，非酒精性脂肪性肝?。∟on-alcoholic fatty liver disease, NAFLD）在世界范圍內成為最主要的肝臟疾病之一。脂肪酸轉位酶（Fatty acid translocase， FAT/CD36）作為介導長鏈脂肪酸細胞攝取的膜糖蛋白，在FFA的跨膜轉運中起重要作用。本課題旨在觀察棕櫚酸對HepG2細胞CD36表達和翻譯后修飾的作用，并由此造成的對細胞脂質積聚產生的

2、影響。
　　方法：HepG2細胞用不同濃度的棕櫚酸處理。用雙熒光素酶報告基因檢測CD36啟動子活性；實時熒光定量PCR（real time polymerase chain reaction,RT-PCR）和免疫印跡（western blot）測定CD36 mRNA和蛋白水平；多聚核糖體分析測定蛋白翻譯效率；熒光顯微鏡實時觀測細胞脂肪酸攝入；油紅O染色和游離脂肪酸（free fatty acid,FFA）測定反映胞內脂質含量。將N

3、C-siRNA和CD36-siRNA轉入HepG2細胞中CD36的表達，比較CD36下調后對HepG2細胞內脂質積聚的影響。用定點突變的方法將野生型CD36（WT）改建為棕櫚酰化修飾位點突變的CD36（AA-SS）真核表達載體，并包裝為相應的慢病毒載體，用以感染細胞，并用嘌呤霉素篩選、建立穩(wěn)定細胞模型。用IP-ABE方法檢測細胞CD36棕櫚?；揎棾潭龋挥脀estern-blot和流式細胞技術鑒定CD36在細胞的表達；進一步提取細胞膜脂

4、筏，用western blot方法檢測CD36在細胞膜脂筏中的表達情況；用雙變量流式及實時攝像的方法動態(tài)觀察HepG2對熒光標記游離脂肪酸的攝取。
　　結果：棕櫚酸只在較高濃度（0.16mM、0.32mM時）增加CD36啟動子活性（P<0.05）、mRNA（P<0.05），而在低水平（0.08mM）增加CD36蛋白表達，顯著增加CD36蛋白翻譯效率。油紅O染色發(fā)現(xiàn)與對照組相比，棕櫚酸組細胞內脂滴增多；酶聯(lián)免疫吸附實驗檢測棕櫚酸組（

5、240.17±19.83ng/mg）細胞內FFA含量較對照組（144.61±53.52ng/mg）增多（P<0.05）；熒光顯微鏡發(fā)現(xiàn)棕櫚酸顯著促進了細胞對脂肪酸的攝入。CD36-siRNA組CD36 mRNA與蛋白分別為NC組的0.58±0.08（P＜0.05），0.50±0.10（P＜0.05）。CD36-siRNA組HepG2內脂滴減少，與細胞內FFA定量測定結果相符（ NC組240.17±21.12ng/mg，CD36 siRN

6、A組98.38±14.18ng/mg，P＜0.05），顯微鏡下動態(tài)觀察也證實CD36 siRNA組細胞對脂肪酸的攝入速度明顯慢于NC組細胞。另一方面，棕櫚酸還能顯著促進CD36的棕櫚?；揎?。慢病毒感染HepG2細胞中，超表達細胞內CD36的蛋白表達明顯高于空載體組，并且棕櫚?；蛔兘M內CD36棕櫚?；揎棾潭冉档?。流式細胞術和western blot發(fā)現(xiàn)CD36棕櫚酰化突變后對CD36在細胞的總表達無影響，但脂筏中的CD36占總CD3