炎癥應(yīng)激狀態(tài)下FAT-CD36介導(dǎo)腎損害的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:（第一部分）選取C57BL/6J小鼠及人腎系膜細(xì)胞(humanmesangial cells，HMCs)、人近曲小管上皮細(xì)胞(human proximal tubularcell,HK2)，分別建立體內(nèi)外炎癥模型，觀察在炎癥應(yīng)激狀態(tài)下，腎組織或細(xì)胞脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)酶/CD36（fatty acid translocase/CD36，F(xiàn)AT/CD36）表達(dá)及脂質(zhì)積聚、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、氧化應(yīng)激及纖維化等指標(biāo)變化。（第二部分）利用FAT/CD36

2、低/高表達(dá)或缺失的體內(nèi)外模型，進(jìn)一步探討炎癥應(yīng)激狀態(tài)下FAT/CD36與腎損害發(fā)生的關(guān)系。
　　方法:體內(nèi)外模型的建立:（第一部分）8周齡C57BL/6J雄性小鼠給予高脂肪酸飲食喂養(yǎng)，隨機(jī)分為兩組，非炎癥Casein(-)組及炎癥組Casein(+)。Casein(-)組小鼠給予0.5ml生理鹽水隔日皮下注射，Casein(+)組小鼠則給予同等量10％酪蛋白(Casein)隔日皮下注射，誘導(dǎo)慢性炎癥模型。14周后收集血清、尿液及腎

3、臟組織標(biāo)本。HMCs及HK2細(xì)胞，在軟脂酸(palmitic acid，PA)0.04mmol/l條件下培養(yǎng)，給予細(xì)胞人腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）及人白細(xì)胞介素6（Interleukin-6，IL-6）處理，建立體外炎癥模型。（第二部分）8周齡雄性C57BL/6J小鼠及FAT/CD36敲除(FAT/CD36 knockout，F(xiàn)AT/CD36 KO）小鼠給予高脂肪酸飲食喂養(yǎng)，分為兩組:C

4、57BL/6JCasein(+)組及FAT/CD36 KO Casein(+)組。均隔日給予10％ Casein0.5ml皮下注射，為期14周，誘導(dǎo)慢性炎癥模型。最后收集小鼠尿液、血清及腎組織。運(yùn)用小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的方法建立FAT/CD36 siRNA HMCs、HK2細(xì)胞模型，在PA0.04mmol/l條件下培養(yǎng)，用炎癥因子（TNF-α25ng/ml或IL-620ng/ml

5、）處理建立體外細(xì)胞炎癥模型。進(jìn)一步，利用FAT/CD36 cDNA超表達(dá)質(zhì)粒，基因瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的方法建立FAT/CD36超表達(dá)(FAT/CD36 overexpression，F(xiàn)AT/CD36 OE)細(xì)胞模型。
　　各項(xiàng)指標(biāo)的檢測:（體內(nèi)實(shí)驗(yàn)）酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linkedimmunosorbent assay，ELISA)測定血清炎癥因子，ELISA、實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time polymerase hain

6、 reaction, RT-PCR)及Westernblotting檢測腎臟組織炎癥因子表達(dá);RT-PCR及Western blotting檢測腎組織FAT/CD36的表達(dá);分別以油紅O染色檢測腎臟脂質(zhì)積聚，定量比色法檢測腎臟甘油三酯(triglyceride，TG)，ELISA檢測腎臟游離脂肪酸(free fatty acid，F(xiàn)FA)水平; RT-PCR檢測腎臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激基因，試劑盒檢測腎臟組織過氧化氫含量;RT-PCR及免疫組化染

7、色分別檢測腎臟組織纖維化基因及蛋白表達(dá)，Masson及天狼星紅染色檢測腎臟膠原纖維;檢測小鼠血清肌酐(serum creatinine，Scr)、尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）及24小時(shí)尿蛋白。（體外實(shí)驗(yàn)）RT-PCR及Western blotting檢測炎癥應(yīng)激下腎細(xì)胞FAT/CD36的表達(dá);建立脂肪酸動(dòng)態(tài)攝取熒光檢測實(shí)驗(yàn)技術(shù)，觀測細(xì)胞對(duì)脂肪酸的動(dòng)態(tài)攝取，定量比色法及ELISA分別檢測細(xì)胞TG、FFA含量;R

8、T-PCR檢測炎癥應(yīng)激下細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激基因表達(dá)水平，HMCs及HK2細(xì)胞胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species，ROS)含量由試劑盒檢測;RT-PCR檢測炎癥應(yīng)激下細(xì)胞纖維化基因。
　　結(jié)果:（第一部分）1.Casein皮下注射上調(diào)C57BL/6J小鼠血清中血清淀粉樣蛋白A(serum amyloidA，SAA)、TNF-α含量，同時(shí)腎臟組織TNF-α、IL-6、單核細(xì)胞趨化蛋白1(monocyte chemo

9、attratctantprotein-1，MCP-1)mRNA及蛋白均升高。2.體內(nèi)外炎癥刺激均可上調(diào)腎組織及細(xì)胞FAT/CD36 mRNA及蛋白的表達(dá)，同時(shí)，腎組織及細(xì)胞脂質(zhì)積聚增加，TG及FFA含量增多。3.炎癥應(yīng)激狀態(tài)下，腎組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、氧化應(yīng)激及纖維化水平升高，小鼠血清肌酐升高。
　?。ǖ诙糠郑?.Casein皮下注射FAT/CD36 KO小鼠，腎臟組織炎癥因子TNF-α、IL-6、MCP-1 mRNA及蛋白均較Cas

10、ein皮下注射的C57BL/6J小鼠明顯下降。2.FAT/CD36 KO小鼠或FAT/CD36 siRNAHMCs、HK2細(xì)胞模型，腎臟組織及細(xì)胞脂質(zhì)積聚、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、氧化應(yīng)激及纖維化指標(biāo)均明顯下降，血尿素氮、肌酐及24小時(shí)尿蛋白下降。3.在FAT/CD36超表達(dá)的HMCs、HK2細(xì)胞模型，即使沒有炎癥刺激，胞內(nèi)脂質(zhì)積聚、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激基因、氧化應(yīng)激水平及纖維化基因均表達(dá)增高。
　　結(jié)論:體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)表明，炎癥應(yīng)激狀態(tài)下腎臟FAT/CD