缺氧預(yù)處理BMSC-exosomes介導(dǎo)miR-150調(diào)控氧應(yīng)激狀態(tài)下C-kit+CSCs增殖的作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的：干細(xì)胞移植為心肌梗死后受損心肌的修復(fù)帶來(lái)曙光。其中，固有心臟干細(xì)胞（Cardiac Stem Cells，CSCs）因具備心臟譜系細(xì)胞相似的遺傳背景、組織特異性、多分化潛能、低免疫原性及專一性等特性，成為修復(fù)受損心肌最理想的種子細(xì)胞。然而，深入的研究發(fā)現(xiàn)移植的干細(xì)胞在急性心梗后局部惡劣的微環(huán)境下細(xì)胞增殖能力受限，存活率降低，對(duì)受損心肌的修復(fù)效應(yīng)明顯下降。因此，提高CSCs對(duì)受損心肌的修復(fù)療效迫在眉睫。近年來(lái)，干細(xì)胞旁分泌效應(yīng)對(duì)心肌

2、細(xì)胞的修復(fù)作用逐漸受到重視。而外泌體（exosomes）作為干細(xì)胞旁分泌效應(yīng)的主要產(chǎn)物，因其生物安全性及有效性成為目前廣泛用于預(yù)處理干細(xì)胞，促進(jìn)其發(fā)揮生物學(xué)功能的重要策略。研究顯示骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Bone Marrow Stem Cells，BMSCs）源外泌體（BMSC-exosomes）可明顯減少急性心肌梗死后心梗面積，促進(jìn)心功能的修復(fù)。此外，新近研究發(fā)現(xiàn)BMSCs-exosomes可促進(jìn)常氧狀態(tài)下C-kit+CSCs增殖。然而，

3、目前關(guān)于BMSC-exosomes對(duì)氧化應(yīng)激狀態(tài)下C-kit+CSCs增殖的影響及潛在機(jī)制還未見報(bào)道。近年來(lái)，缺氧預(yù)處理已成為促進(jìn)干細(xì)胞在氧化應(yīng)激環(huán)境中生存的主要手段，那么，缺氧預(yù)處理BMSC-exosomes是否可通過(guò)促進(jìn)氧化應(yīng)激環(huán)境中心臟干細(xì)胞的增殖進(jìn)而發(fā)揮心臟修復(fù)功能，其可能涉及的相關(guān)機(jī)制如何？因此，本研究旨在探討缺氧預(yù)處理BMSC-exosomes對(duì)氧化應(yīng)激環(huán)境中C-kit+CSCs增殖的調(diào)控及其相關(guān)作用機(jī)制。
　　方法：

4、⑴按照本課題組前期已熟練掌握的全骨髓細(xì)胞貼壁培養(yǎng)法分離提取大鼠BMSC，采用流式細(xì)胞術(shù)鑒定BMSC表面標(biāo)記抗原表達(dá)情況，用于后續(xù)試驗(yàn)。采用酶消化法聯(lián)合磁珠分選法分離培養(yǎng)大鼠C-kit+CSCs，并用免疫熒光檢測(cè)C-kti表達(dá)情況，并行流式細(xì)胞術(shù)鑒定C-kit+CSCs表面標(biāo)記抗原表達(dá)情況，用于后續(xù)試驗(yàn)。⑵采用PEG聚沉+超速離心清洗及ExoQuick-TC試劑盒提取兩種方法分離提取BMSC-exosomes，電子顯微鏡觀察exosome

5、s的形態(tài)，Western Blot檢測(cè)exosomes標(biāo)記蛋白CD63、CD9及Hsp70表達(dá)情況。⑶以不同濃度的H2O2（50、100、200μM）處理C-kit+CSCs2h探索H2O2模擬氧化應(yīng)激微環(huán)境的最佳濃度，設(shè)立常氧狀態(tài)C-kit+CSCs為對(duì)照組，以CCK-8法檢測(cè)不同濃度H2O2對(duì)C-kit+CSCs活性的影響，結(jié)合CCK-8結(jié)果進(jìn)一步行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，以探討體外建立氧化應(yīng)激微環(huán)境的最佳濃度及時(shí)間。⑷以不同濃度的BMSC

6、-exosomes（100、200、300、400、500ug/mL）處理C-kit+CSCs不同時(shí)間（6、12、18、24h），用CCK-8檢測(cè)BMSC-exosomes處理C-kit+CSCs最佳濃度及時(shí)間。此外，以DiI熒光染料標(biāo)記BMSC-exosomes并與C-kit+CSCs共培養(yǎng)觀察CSCs對(duì)exosomes的內(nèi)化情況。⑸為驗(yàn)證常氧及缺氧預(yù)處理BMSC-exosomes對(duì)氧化應(yīng)激微環(huán)境下C-kit+CSCs增殖的影響，實(shí)驗(yàn)

7、分為4個(gè)組：Control組：常氧狀態(tài)下的C-kit+CSCs；PBS組：缺氧C-kit+CSCs+PBS處理組；常氧BMSC-exosomes組（Exo-n組）：缺氧C-kit+CSCs+常氧BMSC-exosomes；缺氧預(yù)處理BMSC-exosomes組（Exo-h組）：缺氧C-kit+CSCs+缺氧預(yù)處理BMSC-exosomes。用CCK-8法檢測(cè)不同處理對(duì)細(xì)胞活性的影響；EDU檢測(cè)細(xì)胞增殖能力；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期；RT-

8、PCR及Western blot檢測(cè)各組中增殖相關(guān)蛋白PCNA、細(xì)胞周期蛋白CyclinD1及細(xì)胞周期抑制蛋白P21的表達(dá)。⑹以life2000TM為載體將miR-150mimics轉(zhuǎn)染入氧化應(yīng)激狀態(tài)下C-kit+CSCs作為陽(yáng)性對(duì)照；實(shí)驗(yàn)分為7個(gè)組：Control組：常氧狀態(tài)下的C-kit+CSCs；PBS組：缺氧C-kit+CSCs+PBS處理組；模擬物陰性對(duì)照組（mimics nagetive control， MNC組）：缺氧C

9、-kit+CSCs+miR-150模擬物陰性對(duì)照組；模擬物組（miR-150mimics組）：缺氧C-kit+CSCs+miR-150模擬物組；缺氧預(yù)處理BMSC-exosomes組（Exo-h組）：缺氧C-kit+CSCs+缺氧預(yù)處理BMSC-exosomes組；Exo-h+simiR-150組：缺氧C-kit+CSCs+缺氧預(yù)處理BMSC-exosomes+miR-150 inhibitorExo-h+Scr(-)組：缺氧C-kit

10、+CSCs+缺氧預(yù)處理BMSC-exosomes+miR-150 negtive inhibitor。用RT-PCR檢測(cè)常氧、缺氧預(yù)處理BMSC-exosomes中miR-150表達(dá)情況；同時(shí)檢測(cè)不同處理組細(xì)胞中miR-150及其靶基因SRCIN1表達(dá)情況；Western blot檢測(cè)細(xì)胞中SRCIN1蛋白的表達(dá)情況。為探討外源性轉(zhuǎn)染miR-150mimics及exosomes處理對(duì)C-kit+CSCs干性的影響，予RT-PCR檢測(cè)各組

11、心臟細(xì)胞系標(biāo)記物Nkx2.5、內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物CD31及平滑肌細(xì)胞標(biāo)記物α-SMA mRNA表達(dá)情況。予CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活性；EDU檢測(cè)胞增殖能力；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期；RT-PCR及Western blot檢測(cè)各組中通路蛋白SRC/CLC3、增殖相關(guān)蛋白PCNA、細(xì)胞周期蛋白CyclinD1及細(xì)胞周期抑制子P21的表達(dá)。⑺分別以PP2（SRC抑制劑）及NPPB（CLC3抑制劑）處理CSCs，實(shí)驗(yàn)分為5個(gè)組：Control組：常氧狀

12、態(tài)下的C-kit+CSCs；PBS組：缺氧C-kit+CSCs+PBS處理組；缺氧預(yù)處理BMSC-exosomes組（Exo-h組）：缺氧C-kit+CSCs+缺氧預(yù)處理BMSC-exosomes；Exo-h+PP2組：缺氧C-kit+CSCs+缺氧預(yù)處理BMSC-exosomes+SRC抑制劑；Exo-h+NPPB組：缺氧C-kit+CSCs+缺氧預(yù)處理BMSC-exosomes+CLC3抑制劑。用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活性；EDU檢測(cè)

13、細(xì)胞增殖能力；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期；RT-PCR及Western blot檢測(cè)各組中通路蛋白SRC/CLC3、增殖相關(guān)蛋白PCNA、細(xì)胞周期蛋白CyclinD1及細(xì)胞周期抑制子P21的表達(dá)。
　　結(jié)果：①利用全骨髓細(xì)胞貼壁培養(yǎng)法分離提取BMSCs，在7d左右鏡下可見細(xì)胞基本貼滿培養(yǎng)皿，融合達(dá)85％以上。細(xì)胞增殖速度與細(xì)胞傳代密切相關(guān)，間隔2-3天即可行一次傳代。P3 BMSC細(xì)胞形態(tài)比較均一，為紡錘形，呈魚群樣生長(zhǎng)。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)

14、果顯示：CD90表達(dá)量為99.5%，CD29表達(dá)量為99.3%，CD45表達(dá)量為1.3%。酶消化法聯(lián)合磁珠分選法體外分離培養(yǎng)CSCs48h后鏡下觀察細(xì)胞呈圓形亮點(diǎn)狀、部分細(xì)胞貼壁。4-5天后CSCs生長(zhǎng)加快，6-7天即可基本鋪滿培養(yǎng)瓶瓶底。磁珠分選后行免疫熒光檢測(cè)C-kit呈陽(yáng)性表達(dá)，流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示：CSCs中C-kit表達(dá)量為97.2%，CD45表達(dá)量為2.2%，CD34表達(dá)量為1.7%。②將分離提取出的BMSC-exosomes

15、于電子顯微鏡下觀察見直徑介于30-100nm的雙凹圓盤狀囊泡樣小體；Western Blot檢測(cè)顯示exosomes標(biāo)記蛋白CD63、CD9及Hsp70呈陽(yáng)性表達(dá)。③CCK-8結(jié)果顯示與Control組相比，100μM H2O2處理C-kit+CSCs2h可使C-kit+CSCs活性降低50%左右；流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示與其余3個(gè)處理組相比，100μM H2O2處理C-kit+CSCs2h可導(dǎo)致C-kit+CSCs早期凋亡率達(dá)到最大值（P<

16、0.05），而壞死率無(wú)明顯變化（p>0.05）。因此選定100μM H2O2處理C-kit+CSCs2h作為誘導(dǎo)C-kit+CSCs凋亡的最佳濃度和時(shí)間，在體外模擬急性心梗后氧化應(yīng)激微環(huán)境以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。④CCK-8結(jié)果顯示BMSC-exosomes對(duì)C-kit+CSCs活性的影響呈現(xiàn)出一定的時(shí)間及劑量依賴效應(yīng)。exosomes處理時(shí)間均為24h時(shí)，與300ug/mL組比較，400ug/mL組細(xì)胞活性有所升高（P<0.05）；與500u

17、g/mL組比較差別無(wú)明顯變化（P>0.05）。最終選擇400ug/mL作用24h作為exosomes處理C-kit+CSCs最佳濃度及時(shí)間。DiI標(biāo)記BMSC-exosomes與C-kit+CSCs共培養(yǎng)24h發(fā)現(xiàn)C-kit+CSCs內(nèi)可見紅色熒光，說(shuō)明DiI標(biāo)記的exosomes可被C-kit+CSCs內(nèi)化。⑤CCK-8結(jié)果顯示與Control組比較，PBS組細(xì)胞活性明顯降低（P<0.05）；與PBS組比較，Exo-h組及Exo-n組

18、細(xì)胞活性均明顯升高（P<0.05），且Exo-h組活明顯高于Exo-n組（P<0.05）；EDU結(jié)果顯示與Control組相比，PBS組細(xì)胞增殖率顯降低（P<0.05）；與PBS組比較，Exo-h組及Exo-n組細(xì)胞增殖率均明顯升高（P<0.05），且Exo-h組明顯高于Exo-n組（P<0.05）；流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示與Control組相比，PBS組細(xì)胞周期明顯阻滯于G0/G1期（P<0.05）；與PBS組比較，Exo-h組及Exo-n

19、組細(xì)胞G0/G1期比例降低，S+G2/M期比例明顯升高（P<0.05），且Exo-h組明顯高于Exo-n組（P<0.05）。RT-PCR及Western blot結(jié)果顯示與Control組相比，PBS組PCNA、CyclinD1的表達(dá)明顯降低（P<0.05），P21表達(dá)明顯升高P<0.05）；與PBS組比較，Exo-h組及Exo-n組PCNA、CyclinD1表達(dá)均明顯升高（P<0.05），P21表達(dá)明顯降低（P<0.05）；且Exo-

20、h組較Exo-n組更加明顯（P<0.05）。⑥RT-PCR結(jié)果顯示缺氧預(yù)處理的BMSC-exosomes內(nèi)miR-150表達(dá)量明顯高于常氧BMSC-exosomes（P<0.05）。與PBS組比較，miR-150 mimics、Exo-h處理后C-kit+CSCs中miR-150表達(dá)明顯升高（P<0.05），而MNC組miR-150表達(dá)無(wú)明顯差異（P>0.05）；與Exo-h組比較，Exo-h+simiR-150組miR-150表達(dá)明顯

21、降低（P<0.05），而Exo-h+Scr(-)組miR-150表達(dá)無(wú)明顯差異（P>0.05）。RT-PCR結(jié)果顯示各組間C-kit+CSCs中SRCIN1 mRNA表達(dá)無(wú)明顯差異（P>0.05）。Western blot結(jié)果顯示與PBS組比較，miR-150 mimics組、Exo-h組SRCIN1蛋白表達(dá)明顯降低（P<0.05）；與Exo-h組比較，Exo-h+simiR-150組SRCIN1表達(dá)明顯升高（P<0.05）。RT-PC

22、R顯示miR-150mimics轉(zhuǎn)染及exosomes處理后各組中心臟細(xì)胞系標(biāo)記物Nkx2.5、內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物CD31及平滑肌細(xì)胞標(biāo)記物α-SMA mRNA表達(dá)情況無(wú)明顯差異（P>0.05），表明不同處理對(duì)C-kit+CSCs干性無(wú)明顯影響。CCK-8結(jié)果顯示與PBS組比較，miR-150 mimics組、Exo-h組細(xì)胞活性明顯升高（P<0.05）；與Exo-h組比較，Exo-h+simiR-150組細(xì)胞活性明顯降低（P<0.05）。

23、EDU結(jié)果顯示與PBS組比較，miR-150 mimics組、Exo-h組細(xì)胞增殖率明顯升高（P<0.05）；與Exo-h組比較，Exo-h+simiR-150組細(xì)胞增殖率明顯降低（P<0.05）。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示與PBS組比較，miR-150 mimics組、Exo-h組細(xì)胞S+G2/M期比例明顯升高（P<0.05）；與Exo-h組比較， Exo-h+simiR-150組細(xì)胞S+G2/M期比例明顯降低（P<0.05）。RT-PCR及

24、Western blot結(jié)果顯示與PBS組比較，miR-150 mimics組、Exo-h組細(xì)胞SRC、CLC3、PCNA、CyclinD1表達(dá)均明顯升高（P<0.05），P21表達(dá)明顯降低（P<0.05）；與Exo-h組比較，Exo-h+simiR-150組細(xì)胞SRC、CLC3、PCNA、CyclinD1表達(dá)均明顯降低（P<0.05），P21表達(dá)明顯升高（P<0.05）。⑦CCK-8結(jié)果顯示與Exo-h組比較，Exo-h+PP2及Ex

25、o-h+NPPB組細(xì)胞活性明顯降低（P<0.05）；EDU結(jié)果顯示與Exo-h組比較，Exo-h+PP2組及Exo-h+NPPB組細(xì)胞增殖率明顯降低（P<0.05）；流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示與Exo-h組比較， Exo-h+PP2組及Exo-h+NPPB組細(xì)胞S+G2/M期比例明顯降低（P<0.05）；RT-PCR及Western blot結(jié)果顯示與Exo-h組比較，Exo-h+PP2組及Exo-h+NPPB組細(xì)胞SRC、CLC3、PCNA、

26、CyclinD1表達(dá)均明顯降低（P<0.05），P21表達(dá)明顯升高（P<0.05）。
　　結(jié)論：⑴常氧及缺氧預(yù)處理的BMSC-exosomes均可促進(jìn)氧化應(yīng)激環(huán)境下C-kit+CSCs增殖，且缺氧預(yù)處理后BMSC-exosomes的促細(xì)胞增殖效果更為明顯。⑵缺氧預(yù)處理的BMSC-exosomes可能主要通過(guò)向C-kit+CSCs傳遞高表達(dá)的miR-150，并通過(guò)靶向調(diào)控其靶基因SRCIN1，進(jìn)一步激活SRC/CLC3信號(hào)通路促進(jìn)氧