缺氧預(yù)處理BMSC-exosome通過microRNA-133a-PLB通路調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激狀態(tài)下CSCs凋亡和鈣穩(wěn)態(tài).pdf

1、目的：大量研究證實(shí)，心臟干細(xì)胞（cardiac stem cell，CSC）移植治療可顯著減輕心肌梗死后心室重構(gòu)，改善心功能，故被認(rèn)為是目前細(xì)胞移植治療心肌梗死最為理想的干細(xì)胞源。然而，心肌梗死后局部微環(huán)境惡劣，致使干細(xì)胞存活量極少。外泌體（exosomes）作為細(xì)胞間信號傳導(dǎo)的重要方式，也是細(xì)胞存活的微環(huán)境的重要組成部分。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Bone Marrow Stem cell，BMSC）來源的外泌體可調(diào)控心臟干細(xì)胞的

2、增殖、分化及凋亡等過程，而缺氧預(yù)處理間充質(zhì)干細(xì)胞可提升其分泌的外泌體抵抗細(xì)胞凋亡的能力。此外，眾所周知，鈣穩(wěn)態(tài)在心肌譜系細(xì)胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及凋亡中均扮演著彌足輕重的地位，以受磷蛋白（Phospholamban，PLB）等蛋白為主的細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣庫平衡最關(guān)鍵的內(nèi)平衡調(diào)節(jié)系統(tǒng)，調(diào)節(jié)了細(xì)胞內(nèi)約44％的鈣離子。有研究表明，BMSCs源外泌體內(nèi)富集microRNA-133a，其在心臟譜系細(xì)胞中可發(fā)揮強(qiáng)大的抗凋亡能力，并可能參與細(xì)胞的鈣穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)過程。本研

3、究前期預(yù)實(shí)驗(yàn)初步證實(shí)，缺氧預(yù)處理BMSC-exosome可以抑制氧化應(yīng)激狀態(tài)下的C-kit+CSC凋亡，那是否是通過microRNA-133a來發(fā)揮作用的呢？是否也是通過作用于以PLB等蛋白為主的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣庫系統(tǒng)來調(diào)節(jié)了其鈣穩(wěn)態(tài)進(jìn)而抑制的凋亡呢？綜上所述，本研究旨在探討缺氧預(yù)處理BMSC-exosomes對氧化應(yīng)激環(huán)境中C-kit+CSCs抗凋亡作用及其鈣穩(wěn)態(tài)調(diào)控在其中發(fā)揮的重要作用。
　　方法：⑴采用組織塊貼壁法培養(yǎng)SD大鼠BMS

4、Cs，采用流式細(xì)胞技術(shù)鑒定其純度，選取P3-P5代BMSCs備用。以不同濃度的H2O2作用于BMSCs不同時(shí)間以模擬缺氧預(yù)處理環(huán)境，采用CCK-8法檢測細(xì)胞活性，確定促使BMSCs活性達(dá)最大值的H2O2最佳濃度和時(shí)間。⑵采用SBI試劑盒法、PEG法、qEV試劑盒法提取骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞源外泌體，采用蛋白質(zhì)印跡法（western blot，WB）檢測外泌體表面標(biāo)記蛋白的表達(dá)情況，采用電子顯微鏡及納米顆粒跟蹤分析技術(shù)（Nanoparticle

5、 Tracking Analysis，NTA）分析所提取外泌體的大小，從平均粒徑、蛋白濃度及顆粒擬合濃度等方面對比各方法優(yōu)劣并選取最優(yōu)方法提取外泌體。⑶采用酶消化法聯(lián)合磁珠分選法體外分離、培養(yǎng)大鼠C-kit+CSCs，采用免疫熒光檢測CSCs表面c-kit的表達(dá)情況，采用流式細(xì)胞術(shù)鑒定細(xì)胞純度。同時(shí)，以不同濃度的H2O2作用c-kit+CSC不同時(shí)間以模擬氧化應(yīng)激環(huán)境，選取使c-kit+CSC達(dá)到最大凋亡程度的H2O2最佳作用濃度和時(shí)間

6、。⑷采用DiI對所提取的BMSC-exosome進(jìn)行染色標(biāo)記，并將之與C-kit+CSCs共培養(yǎng)0、1、6、12、24h，觀察c-kit+CSC對BMSC-exosome的內(nèi)化攝取情況，確定最佳共培養(yǎng)時(shí)間。⑸將BMSC-exosome濃度分為0、100、200、400、800ng/μL組，分別與c-kit+CSC共培養(yǎng)，以cck8法檢測其活性，確定使C-kit+CSC達(dá)最大活性的BMSC-exosome濃度。⑹將實(shí)驗(yàn)分為四組：常氧對照組

7、（normal組）：不予以任何處理的CSCs；對照組（control組）：以H2O2處理模擬氧化應(yīng)激狀態(tài)的CSCs；常氧外泌體組（N-exo組）：與常氧狀態(tài)BMSC-exosome共培養(yǎng)的氧化應(yīng)激狀態(tài)C-kit+CSCs組；缺氧外泌體組（H-exo組）：與經(jīng)缺氧預(yù)處理的BMSC-exosome共培養(yǎng)的氧化應(yīng)激狀態(tài)下C-kit+CSCs組。以Annennexin V-Prodidium iodide（Annexin V-PI）染色，行流式

8、細(xì)胞熒光分選技術(shù)（Fluorescence activated Cell Sorting，F(xiàn)ACS）檢測各組細(xì)胞凋亡情況；采用WB檢測凋亡相關(guān)蛋白caspase8、caspase9、cleaved-caspase3的蛋白表達(dá)情況；以fluo-8進(jìn)行染色并采用激光共聚焦顯微鏡檢測細(xì)胞內(nèi)鈣超載情況。⑺為明確H-exo調(diào)控氧化應(yīng)激狀態(tài)C-kit+CSCs鈣超載的機(jī)制，實(shí)驗(yàn)分為三組：normal組；control組；H-exo組。行WB檢測H-

9、exo對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣庫調(diào)節(jié)系統(tǒng)最主要調(diào)控蛋白，即心肌肌漿網(wǎng)Ca2+-ATP酶2a（sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase2a，SERCA2a）、受磷蛋白（Phosphoprotein，PLB）、2型蘭尼堿受體（Ryanodine Receptor2，RyR2）的蛋白表達(dá)水平的影響。⑻為明確其機(jī)制，我們采用RT-PCR檢測N-exo及H-exo組內(nèi)micorRNA-133a mRNA水平表達(dá)情況，以明確缺氧預(yù)處理

10、對BMSC-exosome中micorRNA-133a表達(dá)的影響。⑼隨后實(shí)驗(yàn)分為四組：normal組；control組；N-exo組；H-exo組。以RT-PCR分別檢測各組CSCs內(nèi)micorRNA-133amicroRNA表達(dá)情況，以明確BMSC-exosome作用后對C-kit+CSCs內(nèi)micorRNA-133amicroRNA表達(dá)的影響。⑽以life2000TM為載體將micorRNA-133amicroRNA抑制劑及模擬物及

11、其陰性對照物（50nM）轉(zhuǎn)染至C-kit+CSCs，以抑制及過表達(dá)氧化應(yīng)激狀態(tài)下C-kit+CSCs內(nèi)microRNA-133a的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)分為六組：Control組；H-exo組；轉(zhuǎn)染mimic-micorRNA-133a組（mimic組）：轉(zhuǎn)染micorRNA-133a mimic，隨后加入H2O2誘導(dǎo)細(xì)胞處于氧化應(yīng)激狀態(tài)組；轉(zhuǎn)染mimic模擬物的陰性對照組（mimics nagetive control，MNC組）：轉(zhuǎn)染micor

12、RNA-133a mimic的模擬物，隨后加入H2O2誘導(dǎo)細(xì)胞處于氧化應(yīng)激狀態(tài)組；作為負(fù)性對照的inhibitor組（inbihitor組）：轉(zhuǎn)染micorRNA-133a siRNA作為micorRNA-133a抑制劑，隨后加入H2O2誘導(dǎo)細(xì)胞處于氧化應(yīng)激狀態(tài)組；作為負(fù)性對照的陰性對照的inhibitor-negative組（INC組）：轉(zhuǎn)染micorRNA-133a siRNA的模擬物作為micorRNA-133a siRNA的陰性

13、對照組，隨后加入H2O2誘導(dǎo)細(xì)胞處于氧化應(yīng)激狀態(tài)組。以RT-PCR分別檢測各組細(xì)胞中micorRNA-133a及PLB mRNA的表達(dá)變化；采用WB檢測各組細(xì)胞中凋亡蛋白caspase8、caspase9和cleaved-caspase3及通路蛋白PLB的表達(dá)情況；采用Annexin V-PI染色，行FACS檢測各組中細(xì)胞凋亡情況；采用fluo-8染色，行激光共聚焦顯微鏡檢測各組中細(xì)胞鈣離子情況。⑾為進(jìn)一步明確PLB在H-exo調(diào)控氧化

14、應(yīng)激狀態(tài)下C-kit+CSCs鈣穩(wěn)態(tài)和凋亡中的作用，我們以life2000TM為載體將PLB抑制劑（siRNA）轉(zhuǎn)入C-kit+CSCs中行抑制實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為4組，即：Control組；H-exo組；轉(zhuǎn)染siRNA的陽性對照組（PLB siRNA組）：轉(zhuǎn)染siRNA-PLB，隨后加入H2O2誘導(dǎo)細(xì)胞處于氧化應(yīng)激狀態(tài)組；轉(zhuǎn)染PLB的siRNA模擬物作為陰性對照組（SNC組）：轉(zhuǎn)染siRNA nagetive control，隨后加入H2O

15、2誘導(dǎo)細(xì)胞處于氧化應(yīng)激狀態(tài)。行RT-PCR檢測各組中PLB mRNA的表達(dá)情況；采用WB檢測各組中凋亡蛋白caspase8、caspase9和cleaved-caspase3及通路蛋白PLB的表達(dá)情況；采用FACS檢測各組細(xì)胞凋亡情況；采用fluo-8染色，行激光共聚焦顯微鏡檢測各組中細(xì)胞鈣穩(wěn)態(tài)情況。
　　結(jié)果：⑴BMSCs培養(yǎng)48h后部分細(xì)胞開始貼壁生長，P3-5代時(shí)細(xì)胞呈峰谷狀或漩渦狀生長。FACS結(jié)果顯示：BMSC表面標(biāo)記物

16、CD29及CD90分別表達(dá)99.7%和96.8%，而白細(xì)胞標(biāo)記物CD45表達(dá)僅為1.17%。CCK8結(jié)果示，與其余各組相比，以100μmol/L H2O2處理2h時(shí)，BMSCs活性達(dá)到最大值（P<0.05）。⑵采用exoquick、qEV、PEG三種方法提取BMSC上清液中的exosome。WB結(jié)果顯示，三組外泌體CD63蛋白表達(dá)均為陽性。電鏡示，exosome呈茶托樣或杯口樣，直徑在30-150nm之間。NTA結(jié)果示，exoqucik

17、、qEV、PEG所提外泌體峰值分別為：139nm、161nm、163nm。結(jié)合外泌體濃度、純度等相關(guān)結(jié)果，最終選取exoqucik試劑盒法進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。WB結(jié)果顯示，以細(xì)胞碎片為對照，經(jīng)exoquick提取的外泌體中CD63、CD9、ALIX表達(dá)均為陽性。⑶原代CSCs貼壁第二天可見部分細(xì)胞呈圓形亮點(diǎn)狀，第3-5天CSCs逐漸變?yōu)殚L梭形。磁珠分選后行免疫熒光鑒定結(jié)果顯示，c-kit陽性的CSCs達(dá)90%以上；FACS結(jié)果顯示： CSC

18、s陽性率91.26%，表達(dá)CD45的CSCs為0.65%，表達(dá)CD34的CSCs僅為0.32%。Annexin V-PI FACS示：與normal組（總體凋亡率2.6%）相比，在100μmol/L H2O2處理2h時(shí)總體凋亡率達(dá)到95.86%（P<0.05）。⑷采用DiI染色檢測對BMSC-exosome進(jìn)行Dil染色，采用免疫熒光觀察CSC對BMSC-exosome的內(nèi)化攝取情況。結(jié)果顯示：在共培養(yǎng)24h時(shí)，被DiI染色的外泌體可被

19、CSC完全內(nèi)化吸收。⑸采用CCK-8法檢測不同濃度BMSC-exosome對CSCs細(xì)胞活性的影響，結(jié)果顯示：BMSC-exosome作用濃度為400ng/μl時(shí)氧化應(yīng)激狀下C-kit+CSCs活性達(dá)到最大值（P<0.05）。⑹將實(shí)驗(yàn)分為四組：常氧對照組（normal組）；對照組（control組）；常氧外泌體組（N-exo組）；缺氧外泌體組（H-exo組），行Annexin V-PI FACS檢測細(xì)胞凋亡率，結(jié)果示：與normal組相

20、比，control組的細(xì)胞凋亡率明顯上升（P<0.05）；與control組相比， N-exo組和H-exo組均可抑制氧化應(yīng)激狀態(tài)下c-kit+CSCs總體凋亡率和早期凋亡率（P<0.05），且H-exo組的抗凋亡作用更為顯著（P<0.05）；此外，H-exo組可明顯抑制c-kit+CSCs晚期凋亡率（P<0.05）。WB結(jié)果示：與normal組相比，control組凋亡相關(guān)蛋白caspase8、caspase9和cleaved-cas

21、pase3的蛋白水平表達(dá)明顯上升（P<0.05）；與control組相比， H-exo組可明顯抑制cleaved-caspase3、caspase8、caspase9蛋白表達(dá)（P<0.05），而N-exo組則只可抑制cleaved-caspase3、caspase9蛋白表達(dá)（P<0.05）。激光共聚焦顯微鏡結(jié)果示：與control組相比， H-exo組和N-exo組均可明顯抑制CSC內(nèi)鈣離子熒光強(qiáng)度（P<0.05），且H-exo組抑制效

22、果更為明顯（P<0.05）。⑺將實(shí)驗(yàn)分為三組：normal組；control組；H-exo組。采用WB檢測SERCA2a、PLB、RyR2的蛋白水平表達(dá)。結(jié)果示：與normal組相比，control組和H-exo組SERCA2a和PLB蛋白水平表達(dá)均明顯下降（P<0.05），RyR2蛋白水平表達(dá)明顯上升（P<0.05）；與control組相比，H-exo組SERCA2a蛋白水平表達(dá)明顯上升（P<0.05），PLB和RyR2蛋白水平表達(dá)明

23、顯下降（P<0.05）。⑻采用RT-PCR檢測N-exo組和H-exo組外泌體內(nèi)micorRNA-133a mRNA的表達(dá)，結(jié)果示：與N-exo組相比， H-exo組內(nèi)micorRNA-133a mRNA表達(dá)明顯上升（P<0.05）。⑼將實(shí)驗(yàn)分為四組：normal組；control組；N-exo組；H-exo組。采用RT-PCR檢測各組細(xì)胞內(nèi)microRNA-133a mRNA表達(dá)水平，結(jié)果示：與normal組相比， control組m

24、icorRNA-133a mRNA表達(dá)水平明顯上升（P<0.05）；與control組相比，H-exo組內(nèi)micorRNA-133a mRNA表達(dá)水平明顯上升（P<0.05）。⑽實(shí)驗(yàn)分為六組：Control組；H-exo組；mimic組；MNC組；inbihitor組；INC組。FACS結(jié)果示：與mimic組相比，control組早期凋亡率、晚期凋亡率和總體凋亡率明顯上升（P<0.05），H-exo組早期凋亡率、晚期凋亡率和總體凋亡率明

25、顯下降（P<0.05）；與inhibitor組相比， control組晚期凋亡率明顯上升（P<0.05），早期凋亡率和總體凋亡率明顯下降（P<0.05），H-exo組早期凋亡率明顯上升（P<0.05），晚期凋亡率和總體凋亡率明顯下降（P<0.05），壞死率明顯減少（P<0.05）。WB結(jié)果示：與 mimic組相比， H-exo組 caspase8、cleaved-caspase3蛋白水平明顯下降（P<0.05）， inhibitor組

26、caspase9、cleaved-caspase3蛋白水平明顯上升（P<0.05）；與inhibito組相比， H-exo組caspase8、caspase9、cleaved-caspase3蛋白水平表達(dá)明顯下降（P<0.05），mimic組caspase9、cleaved-caspase3蛋白水平明顯下降（P<0.05）。這表明，過表達(dá)microRNA-133a可明顯抑制caspase9和cleaved-caspase3蛋白水平表達(dá)，

27、但對caspase8蛋白水平影響不大。CLSM結(jié)果示：與mimic組相比，control組和H-exo組熒光強(qiáng)度明顯上升（P<0.05）；與control組相比，H-exo組鈣離子熒光強(qiáng)度明顯下降（P<0.05）；與inhibitor組相比，H-exo組和mimic組鈣離子熒光強(qiáng)度明顯下降（P<0.05），但與control組相比，H-exo組鈣離子熒光強(qiáng)度情況仍存在明顯差異（P<0.05）。⑾針對各組PLB蛋白表達(dá)水平情況，WB結(jié)果示

28、：與mimic組相比，control組PLB蛋白水平表達(dá)明顯上升（P<0.05），H-exo組表達(dá)明顯下降(P<0.05)；與inhibitor組相比，H-exo組表達(dá)明顯下降（P<0.05）。RT-PCR結(jié)果示，與mimic組相比， H-exo組PLB mRNA水平表達(dá)明顯下降（P<0.05；與inhibitor組相比，H-exo組PLB mRNA水平表達(dá)明顯下降。mimic組與inhibitor組 PLB mRNA表達(dá)水平無明顯差異

29、(P>0.05)。對此，我們認(rèn)為， microRNA-133a對于氧化應(yīng)激狀態(tài)下C-kit+CSCs的PLB調(diào)控可能僅限于蛋白水平。⑿實(shí)驗(yàn)分為4組，即：Control組、H-exo組、PLB siRNA組、SNC組。將PLB siRNA轉(zhuǎn)染入C-kit+CSCs后，RT-PCR結(jié)果示：與PLB siRNA組相比，control組、H-exo組和SNC組PLB mRNA水平表達(dá)均明顯上升（P<0.05）。WB結(jié)果示,與PLB siRNA組

30、相比，control組、H-exo組和SNC組PLB蛋白水平表達(dá)均明顯上升（P<0.05）。WB檢測各凋亡蛋白，結(jié)果示：與PLB siRNA組相比，control組和SNC組caspase9和 cleaved-caspase3蛋白表達(dá)水平明顯上升（P<0.05），而H-exo組 caspase8、caspase9和 cleaved-caspase3蛋白表達(dá)水平均明顯下降（P<0.05）。本實(shí)驗(yàn)說明抑制PLB可能會導(dǎo)致cleaved-ca

31、spase3和caspase9蛋白表達(dá)水平下降，但對caspase8蛋白水平表達(dá)無明顯調(diào)節(jié)效應(yīng)。激光共聚焦顯微鏡結(jié)果示：與control組相比，siRNA組鈣離子熒光強(qiáng)度程度明顯下降（P<0.05），說明PLB的差異性表達(dá)在H-exo對氧化應(yīng)激狀態(tài)下c-kit+CSCs鈣穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)中扮演著彌足輕重的作用。
　　結(jié)論：①缺氧預(yù)處理BMSC所分泌的exosome對氧化應(yīng)激狀態(tài)下的C-kit+CSCs更具有抗凋亡作用，其抗凋亡效應(yīng)可能與