NAC和雷帕霉素通過抑制鎘誘導(dǎo)神經(jīng)元氧化應(yīng)激和mTOR通路激活抗凋亡機(jī)理研究.pdf

1、本文通過體外分離培養(yǎng)原代小鼠皮質(zhì)神經(jīng)元,運(yùn)用細(xì)胞培養(yǎng)、Western blotting等技術(shù)從細(xì)胞分子生物學(xué)角度,分析N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)和雷帕霉素(Rap)干預(yù)鎘誘導(dǎo)神經(jīng)元ROS和mTOR通路激活抗凋亡的機(jī)制；通過慢性鎘染毒實(shí)驗(yàn)小鼠模型,運(yùn)用HE染色、透射電鏡和免疫組織化學(xué)染色等分析方法,探究了鎘誘發(fā)大腦組織和細(xì)胞損傷過程中,NAC對其變化效應(yīng),綜合分析了NAC拮抗鎘誘導(dǎo)神經(jīng)元介導(dǎo)mTOR通路激活發(fā)揮抗凋亡的機(jī)理。結(jié)果如下

2、:
　　 1.NAC和Rap通過抑制鎘誘導(dǎo)神經(jīng)元ROS和mTOR通路激活抗凋亡以原代小鼠皮質(zhì)神經(jīng)元為對象,將分離的原代神經(jīng)元細(xì)胞懸液接種在96(1×104/孔)或6(5×105/孔或2×106/孔)孔板中培養(yǎng)6天后的大腦皮質(zhì)神經(jīng)元分別用0-120μM CdCl2處理24 h,或用N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC,5 mM)和雷帕霉素(Rap,0.2μg/ml)預(yù)處理1 h和48 h后用10和20μM CdCl2暴露4 h或24 h

3、。采用MTT法分析細(xì)胞活性,用熒光探針CM-H2DCFDA分析細(xì)胞ROS熒光強(qiáng)度。Western blot測定mTOR通路相關(guān)信號蛋白變化。我們觀察到鎘以濃度依賴的方式誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡,這與鎘誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生和Akt/mTOR通路激活有密切關(guān)系。用ROS清除劑NAC預(yù)處理或mTOR靶向特異抑制劑Rap預(yù)處理,可以通過阻滯ROS產(chǎn)生和mTOR通路激活,明顯削弱鎘誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡。提示:NAC和Rap通過抑制鎘誘導(dǎo)神經(jīng)元ROS和mTOR通路激活

4、抗凋亡。
　　 2.NAC對慢性鎘染毒實(shí)驗(yàn)小鼠大腦組織和細(xì)胞損傷的保護(hù)作用研究選用健康成年ICR小鼠64只,分為對照組(0.9％生理鹽水)和鎘處理10、25或50 mg/L CdCl2處理組誘發(fā)小鼠大腦組織和細(xì)胞損傷,及NAC組,NAC加10、25或50 mg/L CdCl2處理組觀察保護(hù)情況,共8組。鎘采用自由飲水方式,NAC溶于生理鹽水(15 mg/ml)按150 mg/kg體重,每隔1天腹腔注射,連續(xù)4周。采用常規(guī)HE染色

5、觀察組織學(xué)變化和透射電鏡TEM觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化,以及免疫組化分析4E-BP1磷酸化表現(xiàn)。結(jié)果表明:在光學(xué)顯微鏡下,大腦皮層和海馬區(qū)組織結(jié)構(gòu)的變化,大腦顳葉皮層三層結(jié)構(gòu)(CP1-3)出現(xiàn)明顯的混亂等現(xiàn)象,而且底板區(qū)(SP)模糊、心室層(VZ)減少和底板(SP)到中間層(IZ)細(xì)胞松動現(xiàn)象,細(xì)胞異常集中在中間帶,且以鎘濃度依賴的方式呈現(xiàn)大腦顳葉皮層結(jié)構(gòu)不清,部分神經(jīng)細(xì)胞核固縮,出現(xiàn)篩網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)；海馬區(qū)CA1-CA2區(qū)細(xì)胞異位,呈空泡樣變性

6、,海馬齒狀回明顯松散,細(xì)胞間出現(xiàn)間隙。而NAC和Cd聯(lián)合處理組的小鼠在皮層組織學(xué)結(jié)構(gòu)上可以看到NAC明顯的保護(hù)作用,小鼠大腦皮層三層結(jié)構(gòu)明顯。海馬結(jié)構(gòu)齒狀回顆粒細(xì)胞密集,排列均勻,CA1-CA2區(qū)明顯。透射電鏡觀察皮層神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)胞體縮小,神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器結(jié)構(gòu)紊亂,線粒體腫脹。免疫組化結(jié)果證明mTOR信號通路的下游蛋白p-4EBP1以濃度依賴的方式在海馬CA1區(qū)表達(dá),大腦皮層猶以底板層的Ⅰ～Ⅲ層更為密集,海馬區(qū)陽性細(xì)胞沿海馬齒狀回顆粒細(xì)