記憶相關(guān)基因KIBRA抑制Aβ誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡研究.pdf

1、研究背景:
　　阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是一種嚴重危害人類健康的進行性發(fā)展的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，表現(xiàn)為認知功能不斷惡化，日常生活能力進行性減退和喪失。據(jù)WHO和國際阿爾茨海默病協(xié)會估計，目前全球約有4700萬人患有癡呆，預(yù)計2050年將達到13200萬，已成為威脅人類健康的全球性的重大衛(wèi)生問題。近年來針對AD的藥物試驗均以失敗告終，其根本原因在于AD的發(fā)病機制仍不完全明確，尚缺乏有效阻斷或延緩A

2、D發(fā)生發(fā)展的治療靶點，這是當(dāng)前AD研究亟待解決的突出問題。
　　2003年，Kremerskothen等研究者首次描述了腎腦表達蛋白(kidney and brainexpressed protein，KIBRA)基因的特征，作為WWC蛋白家族的一員，僅特異性表達在腎臟（例如腎小球足細胞、腎小管及集合管）和記憶相關(guān)的腦區(qū)（例如海馬和皮質(zhì)）神經(jīng)元細胞內(nèi)。全基因組相關(guān)性研究發(fā)現(xiàn)KIBRA多態(tài)性位點與人類記憶及認知功能存在相關(guān)性，因此K

3、IBRA又被稱為記憶相關(guān)基因。由于記憶障礙是AD最主要的臨床表現(xiàn)之一，KIBRA成為AD的又一個重要的候選基因。KIBRA通過結(jié)合伴侶共同發(fā)揮作用，不僅連接細胞骨架和信號分子，還參與多種細胞功能調(diào)節(jié)，包括細胞極性和遷移，囊泡轉(zhuǎn)運，轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)，特別是對突觸可塑性和記憶形成起到重要作用。在KIBRA基因敲除小鼠中，KIBRA的缺乏加速了α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑丙酸(α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4

4、-isoxazolepropionic acid，AMPA)受體內(nèi)吞，使突觸后膜上的AMPA受體數(shù)目減少，引起海馬區(qū)N-甲基-D-天門冬氨酸(N-methyl-D-asparticacid，NMDA)受體依賴的長時程增強(long term potentiation，LTP)和長時程抑制(long-term depression，LTD)的降低，導(dǎo)致KIBRA基因敲除小鼠的學(xué)習(xí)記憶障礙。
　　AD的核心病理改變?yōu)棣?淀粉樣蛋白(a

5、myloid-β，Aβ)沉積形成的老年斑及高度磷酸化的Tau蛋白形成的神經(jīng)原纖維纏結(jié)。Aβ在腦內(nèi)的異常沉積，可誘發(fā)突觸變性、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、神經(jīng)元變性和凋亡等，最終導(dǎo)致AD的發(fā)生發(fā)展。最近在果蠅上的研究發(fā)現(xiàn)，KIBRA可作為調(diào)控囊泡轉(zhuǎn)運的自噬調(diào)節(jié)因子，參與維持細胞自噬的正常功能，其缺乏會引起自噬囊泡形成和自噬降解的缺陷。一旦自噬囊泡產(chǎn)生或釋放障礙，將會導(dǎo)致大量錯誤折疊蛋白異常蓄積，誘發(fā)細胞凋亡。因此，KIBRA的缺乏與細胞凋亡存在密

6、切聯(lián)系。目前研究已經(jīng)證實了KIBRA與AD密切相關(guān)，Aβ引起的神經(jīng)元凋亡在AD的發(fā)病機制中起重要作用，由此推測KIBRA可能參與Aβ誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡，因此我們的研究主要圍繞著KIBRA在AD中的相關(guān)分子機制展開。
　　研究目的:
　　1.明確在AD轉(zhuǎn)基因動物模型中是否存在KIBRA的表達改變;
　　2.明確KIBRA在神經(jīng)元凋亡中的重要作用;
　　3.研究KIBRA參與Aβ誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡的相關(guān)機制。
　　

7、研究方法:
　　1.動物模型:我們利用APPswe/PSEN1 dE9(APP/PS1)轉(zhuǎn)基因小鼠及KIBRA基因敲除小鼠作為研究對象。APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠是目前AD研究領(lǐng)域應(yīng)用較廣泛的動物模型，購自美國Jackson實驗室;KIBRA基因敲除小鼠是研究KIBRA生物學(xué)功能較理想的動物模型，由內(nèi)布拉斯加大學(xué)醫(yī)學(xué)中心董繼鑫教授贈送。以同窩野生型小鼠作為對照，分別分籠喂養(yǎng)于光照/黑暗為12小時/12小時的恒溫環(huán)境，自由攝食和飲水。

8、
　　2.行為學(xué)檢測:不同月齡的APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠接受Morris水迷宮檢測，觀察其認知功能的改變情況。先行平臺實驗，若在60秒內(nèi)未找到平臺，引導(dǎo)至平臺，臺上停留30秒。連續(xù)5天后，撤去平臺，行探索實驗，第一象限入水。Smart3.0軟件錄像跟蹤系統(tǒng)記錄，分析。指標包括逃逸時間（潛伏期）、探索路程、目標象限探索時間及路程、平臺穿越次數(shù)等。
　　3.細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染:小鼠海馬神經(jīng)元細胞系HT22購自美國加利福尼亞大學(xué)。使用

9、含10％胎牛血清、100U/ml青霉素及0.1 mg/ml鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、含5％ CO2的細胞培養(yǎng)箱中對細胞進行常規(guī)培養(yǎng)。根據(jù)細胞生長情況適時進行細胞傳代、凍存或處理。細胞轉(zhuǎn)染:生長狀態(tài)良好的HT22細胞，病毒感染前一天鋪六孔板，感染當(dāng)天培養(yǎng)基中加入慢病毒懸液進行轉(zhuǎn)染實驗。細胞培養(yǎng)12-24小時后更換為完全培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染72小時后進行熒光顯微鏡下觀察GFP表達情況。
　　4.Aβ1-42寡聚體的制備與鑒定:本

10、實驗中Aβ1-42寡聚體的制備主要參照紐約Rochester醫(yī)學(xué)中心William J.Bowers教授制備方法所進行的。簡而言之，在生物安全柜中使用氣密注射器將222μL六氟異丙醇(hexafluoroisopropanol，HFIP)加入室溫平衡后的粉末狀A(yù)β，充分混勻，得到濃度為1 mmol/L均質(zhì)的Aβ-HFIP溶液。HFIP完全揮發(fā)，得到Aβ1-42的肽膜。然后加入適量的無水二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，D

11、MSO)，充分振蕩混勻、超聲浴后得到5mmol/L的Aβ-DMSO溶液。繼而加入適量PBS將其稀釋得到濃度為50μg/mL(11.1μM)的溶液，4℃冰箱繼續(xù)孵育2周，得到濃度為11.1μM的Aβ1-42寡聚體。每次使用前4℃13，000rpm離心10分鐘，去除雜質(zhì)。
　　5.免疫組織染色:組織經(jīng)固定、脫水、包埋之后進行切片染色。免疫組織化學(xué)染色抗體使用濃度:Aβ，1∶400; Tau，1∶800; P-Tau Thr181，1∶

12、400; KIBRA，1∶100;應(yīng)用DAB體系顯色。免疫熒光染色抗體使用濃度:Tuj1，1∶1000; KIBRA，1∶100;應(yīng)用Alexa Fluor熒光二抗進行熒光染色。通過TUNEL染色檢測組織細胞在凋亡早期過程中細胞核DNA的斷裂情況。每種染色圖片采集后應(yīng)用Image J圖像處理軟件進行圖像分析。
　　6.免疫蛋白印跡:RIPA緩沖液提取組織及細胞中蛋白，SDS-PAGE（8％、10％或12％丙烯酰胺）跑膠，轉(zhuǎn)膜，孵育

13、相對應(yīng)的一抗。檢測APP/PS1小鼠腦內(nèi)KIBRA、Tau、P-TauThr181的表達水平;檢測APP/PS1小鼠腸道KIBRA、Tuj1的表達水平;檢測不同干預(yù)條件下細胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白的表達:活化的caspase3，剪切的PRAP;檢測信號通路相關(guān)蛋白的表達:Akt總蛋白、P-Akt Ser473、PKCζ總蛋白、P-PKCζ Thr410、ERK1/2總蛋白及P-ERK1/2 Thr202/Tyr204。蛋白表達水平應(yīng)用β-act

14、in標化。免疫組織印跡條帶采用Image J軟件進行灰度分析。
　　7.統(tǒng)計學(xué)分析:應(yīng)用GraphPad Prism5進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析。定量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（(X)±S）進行表示。兩組間均數(shù)的比較采用t檢驗，多組間均數(shù)的比較采用ANOVA方差分析。當(dāng)p值小于0.05時，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　研究結(jié)果:
　　1.不同年齡APP/PS1小鼠認知功能、腦內(nèi)Aβ沉積及Tau蛋白水平
　　Morris水迷宮結(jié)果顯示，

15、9月齡和12月齡APP/PS1小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力比同窩對照小鼠均有下降，12月齡更為顯著(p＜0.05，p＜0.01)。應(yīng)用Aβ免疫組織染色方法，發(fā)現(xiàn)5月齡APP/PS1小鼠腦內(nèi)開始出現(xiàn)Aβ沉積，至12月齡，大量的Aβ斑塊沉積在皮層及海馬區(qū)，而同月齡的野生型小鼠腦內(nèi)始終沒有觀察到Aβ斑塊沉積。免疫蛋白印跡分析，12月齡APP/PS1小鼠腦內(nèi)p-Tau Thr181與總Tau表達量均明顯高于對照組，兩組之間存在顯著統(tǒng)計學(xué)差異(p＜0.0

16、1，p＜0.05)。
　　2.KIBRA在APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)特異性表達
　　通過KIBRA免疫組織染色分析，無論整個海馬，還是海馬亞區(qū)CA1區(qū)和CA3區(qū)，9月齡和12月齡APP/PS1小鼠KIBRA陽性細胞數(shù)量均明顯低于對照組，其中12月齡尤為顯著(p＜0.01，p＜0.001)。免疫蛋白印跡結(jié)果同樣證實12月齡APP/PS1小鼠海馬區(qū)KIBRA的表達明顯低于野生型小鼠(p＜0.001)，兩組小鼠皮層KIBRA的表

17、達有升高趨勢，但無統(tǒng)計學(xué)差異(p=0.0937)。我們進行了免疫熒光染色和共聚焦顯微鏡拍攝，發(fā)現(xiàn)KIBRA染色主要定位于神經(jīng)元，而且與對照組小鼠相比，在12月齡APP/PS1小鼠海馬區(qū)神經(jīng)元中，KIBRA陽性染色減少(p＜0.05)，而皮層神經(jīng)元中KIBRA陽性染色增高(p＜0.01)。隨著月齡的增加，KIBRA在APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠海馬區(qū)的表達逐漸減少，提示海馬區(qū)KIBRA的特異性降低與AD的學(xué)習(xí)記憶障礙密切相關(guān)。
　　3.

18、KIBRA在APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腸神經(jīng)系統(tǒng)特異性表達
　　研究發(fā)現(xiàn)，Aβ斑塊和神經(jīng)原纖維纏結(jié)不僅在AD患者腦內(nèi)異常沉積，也出現(xiàn)在AD患者的腸管內(nèi)，可引起線粒體功能障礙、氧化應(yīng)激、神經(jīng)元丟失等，從而導(dǎo)致腸道神經(jīng)功能障礙。免疫熒光染色結(jié)果顯示，12月齡APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠的腸道內(nèi)有大量的Aβ沉積(p＜0.001)。我們進行了整體組織免疫熒光染色和共聚焦顯微鏡拍攝，發(fā)現(xiàn)與對照組小鼠相比，在12月齡APP/PS1小鼠的腸道神經(jīng)元中

19、，KIBRA陽性染色明顯增多(p＜0.05)。免疫蛋白印跡檢測同樣驗證了，在12月齡APP/PS1小鼠腸神經(jīng)系統(tǒng)中KIBRA表達量明顯高于對照組(p＜0.05)，而兩組小鼠神經(jīng)元標志物Tuj1表達量無顯著差異(p=0.9023)。與海馬區(qū)特異性降低不同，KIBRA在APP/PS1小鼠腸神經(jīng)元中表達明顯增高。
　　4.KIBRA在神經(jīng)元凋亡中的重要作用
　　通過TUNEL熒光染色和共聚焦顯微鏡拍攝，我們發(fā)現(xiàn)，與野生型小鼠相比，

20、12月齡APP/PS1小鼠皮層和海馬區(qū)神經(jīng)元凋亡比例明顯增多(p＜0.01，p＜0.01)。4月齡KIBRA基因敲除小鼠海馬區(qū)神經(jīng)元凋亡比例比野生型小鼠明顯增加(p＜0.05)，提示KIBRA在神經(jīng)元凋亡的發(fā)生中扮演不可或缺的角色。
　　5.KIBRA對HT22細胞存活及Aβ誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡的保護作用
　　我們使用CRISPR/CAS9慢病毒及過表達慢病毒分別轉(zhuǎn)染HT22細胞，建立KIBRA基因敲低和KIBRA基因過表達細胞

21、模型。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與空病毒組相比，在接種96小時后， KIBRA敲低組細胞增殖受到抑制(p＜0.001)，KIBRA過表達組細胞增殖明顯加快(p＜0.01)，提示KIBRA是細胞增殖的積極調(diào)控因子。
　　我們使用Aβ1-42寡聚體處理HT22細胞，建立Aβ神經(jīng)毒性細胞模型。CCK8及免疫蛋白印跡結(jié)果顯示，與空病毒組相比，經(jīng)1μM的Aβ1-42寡聚體處理后的KIBRA敲低組細胞活力明顯降低(p＜0.01);凋亡相關(guān)蛋白（剪切的PARP

22、、活化的caspase3）的表達量明顯增高(p＜0.05，p＜0.01)。KIBRA過表達組細胞存活率明顯優(yōu)于空病毒組(p＜0.05)，凋亡相關(guān)蛋白（剪切的PARP、活化的caspase3）較空病毒組顯著減少(p＜0.05)，進一步提示KIBRA參與抑制Aβ誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡，促進細胞增殖和存活。
　　6.KIBRA通過激活A(yù)kt信號通路抑制Aβ誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡
　　本實驗篩選凋亡相關(guān)信號通路，結(jié)果顯示，在1μM Aβ1-42

23、寡聚體處理1分鐘后，空病毒組Akt Ser473位點磷酸化先被激活，KIBRA敲低組Akt Ser473位點磷酸化水平比空病毒組顯著降低(p＜0.05);在1μM Aβ1-42寡聚體處理2分鐘后，KIBRA敲低組Akt Ser473位點磷酸化才被明顯激活。在Aβ1-42寡聚體處理1分鐘后，KIBRA過表達組Akt Ser473位點磷酸化明顯被激活，Akt Ser473位點磷酸化水平比空病毒組顯著增高(p＜0.01)。
　　此外，免

24、疫蛋白印跡結(jié)果顯示，與Aβ1-42寡聚體干預(yù)組相比，MK2206+Aβ1-42寡聚體干預(yù)組KIBRA過表達細胞Akt Ser473位點的磷酸化水平顯著降低(p＜0.05);剪切的PARP表達量明顯增高(p＜0.05)。與Aβ1-42寡聚體干預(yù)組相比，MK2206+Aβ1-42寡聚體干預(yù)組KIBRA過表達細胞存活率明顯降低(p＜0.05)。以上結(jié)果表明KIBRA通過激活A(yù)kt Ser473位點的磷酸化水平，抑制Aβ誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡。

25、>　　結(jié)論:
　　1.隨著月齡的增加，KIBRA在APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠海馬區(qū)的表達明顯減少。KIBRA在海馬區(qū)的特異性降低與AD的學(xué)習(xí)記憶障礙密切相關(guān)，KIBRA作為記憶相關(guān)基因在AD的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。
　　2.KIBRA在海馬神經(jīng)元凋亡中起到不可或缺的作用。
　　3.KIBRA作為一種神經(jīng)保護因子，通過激活A(yù)kt信號通路抑制Aβ誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡，促進細胞增殖及存活，為AD發(fā)病機制及治療藥物的研究提供了新的