傷害性信息傳入誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元凋亡及其機(jī)制初探.pdf

1、目的：近年來(lái)應(yīng)激對(duì)身心健康的影響越來(lái)越受到關(guān)注。應(yīng)激反應(yīng)對(duì)機(jī)體既有有利的一面，也有不利的一面。適度的應(yīng)激反應(yīng)可以動(dòng)員機(jī)體的適應(yīng)系統(tǒng)，提高機(jī)體對(duì)內(nèi)外環(huán)境干擾因素的抵抗能力；持續(xù)或過(guò)強(qiáng)的應(yīng)激反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致不同程度的心理和生理障礙，甚至引起軀體的疾病。臨床發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期處于應(yīng)激狀態(tài)會(huì)導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)心理障礙或記憶力減退等神經(jīng)系統(tǒng)功能改變的現(xiàn)象。 海馬是邊緣系統(tǒng)的重要組成部分，與學(xué)習(xí)、記憶、情緒等功能活動(dòng)有關(guān)。研究資料證實(shí)，應(yīng)激可引起海馬結(jié)構(gòu)和功能

2、的損害，如海馬神經(jīng)元丟失、樹(shù)突的萎縮等。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，慢性心理社會(huì)應(yīng)激可導(dǎo)致海馬不同區(qū)域神經(jīng)元凋亡的發(fā)生。目前關(guān)于應(yīng)激所致海馬神經(jīng)元損傷的研究，主要采用慢性心理應(yīng)激的方法，應(yīng)激原的作用時(shí)間較長(zhǎng)(數(shù)周至數(shù)月)，而有關(guān)急性應(yīng)激對(duì)海馬神經(jīng)元影響的研究較少。 疼痛是臨床上常見(jiàn)的癥狀，常給病人帶來(lái)極大的痛苦。急性炎性痛是否能引起海馬神經(jīng)元凋亡，目前國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。 因此，本實(shí)驗(yàn)觀察了大鼠甲醛炎性痛時(shí)海馬神經(jīng)元凋亡的改變，并

3、觀察了這一改變的時(shí)間特征。在此基礎(chǔ)上，初步探討了甲醛炎性痛誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元凋亡的機(jī)制。 1甲醛炎性痛誘導(dǎo)大鼠海馬神經(jīng)元凋亡健康雄性Sprague-Dawley大鼠35只，體重280±20克，隨機(jī)分為7組，分別為：對(duì)照組，足底一次注射甲醛2d組，足底一次注射甲醛3d組，足底一次注射甲醛4d組，足底兩次注射甲醛2d組，足底兩次注射甲醛3d組，足底兩次注射甲醛4d組。每組5只動(dòng)物。對(duì)照組不加任何處理，直接斷頭取材。足底一次注射甲醛2d、

4、3d、4d組分別于大鼠右側(cè)足底注射0.2ml5％甲醛溶液致外周炎性痛后，于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)直接斷頭取材。足底兩次注射甲醛2d、3d、4d組的動(dòng)物，于大鼠右側(cè)足底注射甲醛后24h時(shí)，左側(cè)足底再注射甲醛一次，于第一次注射后相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)直接斷頭取材。采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)海馬神經(jīng)元的凋亡率；計(jì)數(shù)大鼠自發(fā)縮足次數(shù)，觀察其自發(fā)痛反應(yīng)。 結(jié)果發(fā)現(xiàn)：正常對(duì)照組大鼠海馬神經(jīng)元的凋亡率很低。與對(duì)照組相比，足底一次注射甲醛2d時(shí)，海馬神經(jīng)元凋亡率顯著增高(P

5、＜0.05)，注射甲醛后3d，海馬神經(jīng)元的凋亡率達(dá)高峰，注射甲醛后4d，海馬神經(jīng)元凋亡率有所降低，但仍高于正常對(duì)照組水平(P＜0.05)。足底兩次注射甲醛2d、3d、4d組，與對(duì)照組相比，海馬神經(jīng)元的凋亡率均顯著增高(P＜0.05)，其中以4d組凋亡率增高最為顯著。足底兩次注射甲醛2d、3d組與一次注射甲醛2d、3d組海馬神經(jīng)元的凋亡率相比無(wú)顯著差別(P＞0.05)；而足底兩次注射甲醛4d組海馬神經(jīng)元的凋亡率則明顯高于足底一次注射甲醛4

6、d組，也明顯高于一次注射甲醛3d組(P＜0.05)。 足底注射甲醛可誘導(dǎo)大鼠產(chǎn)生一個(gè)雙相的自發(fā)痛反應(yīng)，表現(xiàn)為自發(fā)性縮足、舔咬患爪等。第一時(shí)相反應(yīng)在注射后立即出現(xiàn)，持續(xù)數(shù)分鐘；第二時(shí)相疼痛反應(yīng)出現(xiàn)在注射甲醛10min后，持續(xù)數(shù)十分鐘之久；兩個(gè)時(shí)相之間存在一個(gè)靜息期。足底第二次注射甲醛后，大鼠自發(fā)縮足次數(shù)于第一時(shí)相(0-5min)與第二時(shí)相(10-60min)均較一次注射后顯著增加(P＜0.05)。 以上結(jié)果表明，甲醛炎性痛

7、可誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元凋亡的發(fā)生，注射甲醛后3d凋亡達(dá)高峰，足底兩次注射甲醛可使疼痛強(qiáng)度增強(qiáng)，并使海馬神經(jīng)元凋亡率進(jìn)一步增加。提示甲醛炎性痛誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元凋亡與疼痛強(qiáng)度有關(guān)。 2甲醛炎性痛誘導(dǎo)大鼠海馬神經(jīng)元凋亡的機(jī)制初探2.1鞘內(nèi)注射NMDA受體拮抗劑MK-801對(duì)甲醛炎性痛誘導(dǎo)的大鼠海馬神經(jīng)元凋亡的影響 健康雄性Sprague-Dawley大鼠49只，體重280±20克，隨機(jī)分為5組，分別為：對(duì)照組，甲醛組，甲醛+生理鹽水

8、(NS)組，甲醛+MK-801(30nmol)組，甲醛+MK-801(60nmol)組。甲醛+MK-801(30nmol)組用大鼠5只，只觀察了海馬神經(jīng)元凋亡率的變化。其余各組均為11只動(dòng)物，其中5只用于海馬神經(jīng)元凋亡率變化的觀察，6只用于觀察海馬神經(jīng)元p53蛋白的表達(dá)。對(duì)照組不加任何處理，直接斷頭取材。其余各組均于大鼠右側(cè)足底注射甲醛后，首先通過(guò)計(jì)數(shù)縮足次數(shù)觀察大鼠自發(fā)痛反應(yīng)，然后于注射甲醛后3d直接斷頭取材。其中甲醛+NS組、甲醛+

9、MK-801(30nmol)組、甲醛+MK-801(60nmol)組分別于足底注射甲醛前15分鐘預(yù)先鞘內(nèi)注射NS、MK-801(30nmol)和MK-801(60nmol)溶液10μl。采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)海馬神經(jīng)元的凋亡率；應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法觀察海馬神經(jīng)元p53蛋白的表達(dá)。 結(jié)果發(fā)現(xiàn)：注射甲醛后，動(dòng)物即出現(xiàn)舔、咬、自發(fā)性收縮注射足等疼痛相關(guān)表現(xiàn)。預(yù)先鞘內(nèi)注射NMDA受體拮抗劑MK-80130nmol或60nmol，均可明顯抑

10、制甲醛誘導(dǎo)的傷害性反應(yīng)，表現(xiàn)為自發(fā)縮足次數(shù)顯著減少，其中60nmol組較30nmol組效果更加明顯。與對(duì)照組相比，甲醛組與甲醛+NS組海馬神經(jīng)元的凋亡率明顯增高(P＜0.05)，但此兩組之間無(wú)顯著性差異。與甲醛+NS組相比，甲醛+MK-801(30nmol)組、甲醛+MK-801(60nmol)組海馬神經(jīng)元的凋亡率均明顯降低(P＜0.05)，基本降至正常對(duì)照組水平，且此兩組之間無(wú)顯著性差異。正常對(duì)照組大鼠海馬CA1、CA3及DG區(qū)均可見(jiàn)

11、少量的p53免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞，這些細(xì)胞染色較淺，左右兩側(cè)無(wú)明顯差異。與對(duì)照組相比，甲醛組與甲醛+NS組大鼠海馬各亞區(qū)p53蛋白的表達(dá)均顯著增強(qiáng)，表現(xiàn)為p53陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量明顯增加(P＜0.05)，染色明顯加深，即灰度值明顯降低(P＜0.05)，左右兩側(cè)海馬之間無(wú)明顯差異，兩組之間p53蛋白的表達(dá)亦無(wú)顯著性差異。與甲醛+NS組相比，甲醛+MK-801(60nmol)組海馬各亞區(qū)p53陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量和陽(yáng)性細(xì)胞染色深度均明顯降低(P＜0.05)，

12、且左右兩側(cè)無(wú)顯著性差異。 以上結(jié)果表明，甲醛炎性痛可以誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元凋亡及p53蛋白的表達(dá)增加，鞘內(nèi)注射MK-801抑制了傷害性信息的傳入，明顯抑制了甲醛炎性痛誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元凋亡及p53蛋白的表達(dá)，提示甲醛炎性痛誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元凋亡主要是由于傷害性信息傳入所引起，傷害性信息傳入誘導(dǎo)的海馬p53蛋白表達(dá)增加可能是海馬神經(jīng)元凋亡的重要機(jī)制之2.2側(cè)腦室注射NMDA受體拮抗劑MK-801對(duì)甲醛炎性痛誘導(dǎo)的大鼠海馬神經(jīng)元凋亡的影響

13、 健康雄性Sprague-Dawley大鼠33只，體重280±20克，隨機(jī)分為3組，分別為：鹽水對(duì)照組，甲醛+生理鹽水(NS)組，甲醛+MK-801(60nmol)組。每組11只動(dòng)物，其中5只用于觀察海馬神經(jīng)元凋亡率的變化，6只用于觀察海馬神經(jīng)元p53蛋白的表達(dá)。各組動(dòng)物均首先于側(cè)腦室埋管，于術(shù)后第7天鹽水對(duì)照組于側(cè)腦室給予10μlNS后，3d直接斷頭取材；甲醛+NS組、甲醛+MK-801(60nmol)組分別于術(shù)后第七天側(cè)腦室給予

14、10μlNS或10μlMK-801(60nmol)溶液，15min分鐘后足底注射甲醛，并于注射甲醛后3d直接斷頭取材。應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)海馬神經(jīng)元凋亡率；用免疫組織化學(xué)方法觀察海馬神經(jīng)元p53蛋白的表達(dá)。 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與鹽水對(duì)照組相比，甲醛+NS組海馬神經(jīng)元凋亡率顯著增高(P＜0.05)，海馬各亞區(qū)p53陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量和陽(yáng)性細(xì)胞染色深度均明顯增加(P＜0.05)，且左右兩側(cè)海馬無(wú)顯著性差異。與甲醛+NS組相比，甲醛+MK-801(

15、60nmol)組海馬神經(jīng)元凋亡率、海馬各亞區(qū)p53陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量和陽(yáng)性細(xì)胞染色深度均明顯降低(P＜0.05)，且左右兩側(cè)無(wú)顯著性差異。 以上結(jié)果表明，側(cè)腦室注射MK-801可抑制傷害性信息傳入誘導(dǎo)的大鼠海馬神經(jīng)元凋亡及海馬神經(jīng)元p53蛋白的表達(dá)，提示興奮性氨基酸(excitatoryaminoacids，EAAs)及其受體的激活可能參與了傷害性信息傳入對(duì)大鼠海馬神經(jīng)元凋亡的誘導(dǎo)；中樞內(nèi)EAAs的釋放及其受體的激活可促進(jìn)p53蛋白的

16、表達(dá)，提示p53蛋白表達(dá)增加可能是傷害性信息傳入誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元凋亡的重要機(jī)制之一。 3結(jié)論大鼠足底注射甲醛所致的炎性痛可誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元凋亡。鞘內(nèi)注射NMDA受體拮抗劑MK-801抑制了傷害性信息的傳入，同時(shí)抑制了甲醛炎性痛誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元凋亡及p53蛋白的表達(dá)，提示傷害性信息的傳入是誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元凋亡發(fā)生的重要機(jī)制。側(cè)腦室注射NMDA受體拮抗劑MK-801可抑制甲醛炎性痛誘導(dǎo)的大鼠海馬神經(jīng)元凋亡及p53蛋白的表達(dá)，提示中樞內(nèi)EA