化學(xué)法誘導(dǎo)BMSCs向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化后MET相關(guān)基因表達(dá)量的變化.pdf

1、背景介紹:
　　骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)是Friedenstein等在1987年首次發(fā)現(xiàn)。隨后的研究發(fā)現(xiàn)，間充質(zhì)干細(xì)胞廣泛存在于臍帶血、骨髓，甚至外周循環(huán)血等，按照來源分類屬于間充質(zhì)細(xì)胞，是由原腸胚期的中胚層細(xì)胞分化發(fā)育形成的。由于此類干細(xì)胞在體內(nèi)外保持相對(duì)無限的增殖能力，也易于進(jìn)行體外的培養(yǎng)和純化，并且可以在化學(xué)試劑或者細(xì)胞因子的刺激下分化為多種間質(zhì)細(xì)胞類型，或者分化

2、為神經(jīng)樣細(xì)胞[1]。因此BMSCs被公認(rèn)為基礎(chǔ)研究和臨床治療的一種優(yōu)秀的干細(xì)胞源。
　　間質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)化(Mesenchymal-epithelial transition，MET)及其逆向過程上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是生物體在生理和病理狀態(tài)下普遍存在的現(xiàn)象。目前認(rèn)為MET和EMT大體上可歸為三個(gè)范疇:(1)胚胎發(fā)育的原腸胚形成;(2)創(chuàng)傷愈合與纖維化;(3)癌細(xì)胞

3、的病理發(fā)生。不僅細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，而且細(xì)胞的蛋白組成、轉(zhuǎn)錄因子和基因表達(dá)等諸多特性都發(fā)生了變化。發(fā)生改變的分子包括:E-鈣粘蛋白（E-cadherin）、N-cadherin、Vimentin、生長因子TGF-β、EGF，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子Snail、Slug、ZEB1和ZEB2等，對(duì)于判斷EMT/MET的發(fā)生及探討其機(jī)制也具有重要意義。目前研究表明Wnt/β-catenin信號(hào)參與生理和病理的EMT/MET的調(diào)節(jié)過程。在腎小管發(fā)育中，敲除W

4、nt4a基因可有效阻斷間質(zhì)干細(xì)胞遷移和組織局部腎小管上皮細(xì)胞的形成。采用基因敲減的方法干擾Wnt/β-catenin通路對(duì)于EMT介導(dǎo)的腫瘤發(fā)生也有有效的逆轉(zhuǎn)作用。
　　具有間質(zhì)特性的BMSCs在化學(xué)誘導(dǎo)劑作用下，分化為上皮特質(zhì)的神經(jīng)元樣細(xì)胞，是否具有與其它MET過程相似的基因表達(dá)變化、細(xì)胞增殖特性變化和類似的分子機(jī)制，這一問題尚未見報(bào)道。
　　本實(shí)驗(yàn)室已采用化學(xué)誘導(dǎo)劑成功誘導(dǎo)大鼠BMSCs向神經(jīng)元樣細(xì)胞的分化，并證明分化細(xì)

5、胞表達(dá)神經(jīng)元/神經(jīng)干細(xì)胞的特異性標(biāo)志蛋白NSE，nestin等，且初具神經(jīng)元的電生理學(xué)特征。闡明BMSCs向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化中MET相關(guān)分子的變化，將有助于深入探討MET/EMT的分子機(jī)制，為研究MET/EMT相關(guān)的疾病病理（如腫瘤發(fā)生等）提供思路。同時(shí)，基于BMSCs體外培養(yǎng)和研究的便利性，或能成為體外研究MET/EMT的細(xì)胞工具。
　　目的:
　　本實(shí)驗(yàn)擬采用大鼠BMSCs(P3-P5)經(jīng)化學(xué)試劑DMSO/BHA聯(lián)合誘導(dǎo)

6、其轉(zhuǎn)化為神經(jīng)元樣細(xì)胞，用RT-PCR方法分別檢測(cè)誘導(dǎo)前后細(xì)胞表面蛋白(E-cadherin、 N-cadherin等)表達(dá)量的變化，以及MET相關(guān)分子Slug、 Snail、ZEB1、ZEB2、vimintin、 Twist等的基因表達(dá)的變化。同時(shí)，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)并比較上述誘導(dǎo)前后細(xì)胞周期，比較細(xì)胞增殖特性。為了探索BMSCs向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化過程中Wnt/β-catenin信號(hào)是否參與MET的調(diào)控，我們還將檢測(cè)通路的相關(guān)分子C-m

7、yc、Axin2、β-catenin等的基因表達(dá)變化。
　　方法:
　　1.SD大鼠股骨骨髓提取。取出生4-6周內(nèi)，體重在100-120g之間的雄性SD大鼠頸錐脫臼處死，75％酒精中消毒后，在無菌條件下剝離大鼠股骨，剪去兩側(cè)，用DMEM/F12培養(yǎng)基分別從兩端切口沖洗骨髓腔，收集所有細(xì)胞至培養(yǎng)皿中，離心以及PBS洗滌后，接種至無菌的培養(yǎng)瓶中(P0)，37℃恒溫，5％CO2以及飽和濕度條件下培養(yǎng)。
　　2.BMSC的純化

8、培養(yǎng)。首先，在P0細(xì)胞培養(yǎng)24h后，更換新鮮培養(yǎng)基，并棄去未貼壁細(xì)胞。當(dāng)P0細(xì)胞生長至大約覆蓋培養(yǎng)瓶底部60％-70％時(shí)，按照1∶2的比例進(jìn)行細(xì)胞傳代，使用P3代以后的細(xì)胞（呈現(xiàn)高度的細(xì)胞形態(tài)的均一性和高度的增殖特性）進(jìn)行下述實(shí)驗(yàn)。
　　3.化學(xué)誘導(dǎo)法誘導(dǎo)BMSCs細(xì)胞向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化。取第4代左右(P3-P5)的BMSCs細(xì)胞，誘導(dǎo)組使用誘導(dǎo)培養(yǎng)液（10％FBS的DMEM-F12培養(yǎng)基，含bFGF10ng/ml，），對(duì)照組（非

9、誘導(dǎo)組）使用完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)24小時(shí)。之后，誘導(dǎo)組棄去預(yù)誘導(dǎo)培養(yǎng)液，加入含BHA200μmol/L和2％DMSO的DMEM-F12培養(yǎng)液進(jìn)行化學(xué)誘導(dǎo)。對(duì)照組更換等量的完全培養(yǎng)基。持續(xù)觀察細(xì)胞形態(tài)變化。視細(xì)胞分化情況4-6h內(nèi)終止誘導(dǎo)。
　　4.MET相關(guān)分子的表達(dá)量變化的檢測(cè)。采用總RNA提取試劑盒分別提取實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的RNA，Nanodrop精確測(cè)定濃度，并以相同量的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用相對(duì)定量PCR法檢測(cè)MET相關(guān)分

10、子E-cadherin，N-cadherin、Slug、 Snail、ZEB1、ZEB2、vimintin、 Twist等蛋白在誘導(dǎo)前后的BMSCs和神經(jīng)樣細(xì)胞中的表達(dá)量的變化，并根據(jù)-σTT計(jì)算實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比獲得基因表達(dá)量的相對(duì)比值。GAPDH為內(nèi)參基因，ROX為加樣參照熒光。5.MET的可能調(diào)控通路Wnt/β-catenin通路靶基因得檢測(cè)。采用上述相同方法獲得RNA及反轉(zhuǎn)為cDNA，相對(duì)定量PCR法檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的C-my

11、c、Axin2、β-catenin在誘導(dǎo)前后的BMSCs和神經(jīng)樣細(xì)胞中的表達(dá)量變化，同樣根據(jù)-σTT計(jì)算實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比獲得基因表達(dá)量的相對(duì)比值。 GAPDH為內(nèi)參基因，ROX為加樣參照熒光。
　　6.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)BMSCs和誘導(dǎo)后神經(jīng)元樣細(xì)胞的增殖特性改變。取實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞，乙醇固定后采用PI染色，使用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)兩組細(xì)胞的細(xì)胞周期分布。
　　7.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析處理。

12、對(duì)計(jì)量資料，同一時(shí)間點(diǎn)各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間比較用兩樣本t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用x2檢驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±s）表示。以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)，P＜0.05為差異有顯著性。
　　結(jié)果:
　　1.采用骨髓細(xì)胞獲取和在體外培養(yǎng)純化(＞P3)后，BMSCs呈高純度的形態(tài)均一的細(xì)胞群，絕大多數(shù)為扁平紡錘形細(xì)胞。并且保持增殖特性，密集細(xì)胞聚集在一起呈現(xiàn)并排的螺旋排列。
　　2.經(jīng)DMSO/BHA聯(lián)合誘導(dǎo)的BMSCs細(xì)胞

13、在4-6小時(shí)后形態(tài)上呈現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)部分向細(xì)胞核方向收縮集中，胞體縮小呈圓形，形成細(xì)長突起與周圍細(xì)胞成網(wǎng)狀聯(lián)系，即出現(xiàn)典型的神經(jīng)元樣細(xì)胞。
　　3.相對(duì)定量PCR檢測(cè)MET相關(guān)分子的表達(dá)顯示，化學(xué)誘導(dǎo)BMSCs的神經(jīng)元樣細(xì)胞中，“M（間質(zhì)）”特性分子（Slug、 Snail、ZEB1、ZEB2、vimintin、Twist等）表達(dá)顯著下調(diào)。
　　4.相對(duì)定量PCR檢測(cè)MET調(diào)控信號(hào)Wnt/β-catenin通路的靶基因顯示，化學(xué)誘