h-MSCs的體外培養(yǎng)及向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化的研究.pdf

1、目的：采用體外分離、培養(yǎng)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(human Mesenchymal stem cells,h-MSCs),以及用堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)和不同濃度的睫狀神經(jīng)節(jié)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(ciliary neurotrophic factor,CNTF)對(duì)其進(jìn)行預(yù)誘導(dǎo)及誘導(dǎo),通過(guò)觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化,及免疫細(xì)胞化學(xué)染色 CD34、CD44、CD54、NSE和Nestin的

2、表達(dá),探討建立一種較簡(jiǎn)便有效的體外擴(kuò)增培養(yǎng)h-MSCs的體系,以及CNTF對(duì)h-MSCs分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞的誘導(dǎo)作用和適宜的誘導(dǎo)濃度。
　　方法：骨髓來(lái)源于南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院和第一醫(yī)院血液內(nèi)科行骨髓穿刺檢查患者(經(jīng)患者同意),已排除腫瘤、傳染病及血液系統(tǒng)疾病,年齡18～55歲,性別不限,男39例,女29例,共68例。采用密度梯度離心法和全骨髓貼壁法相結(jié)合的方法,分離獲得h-MSCs,利用含血清的DMEM/F12培養(yǎng)基體外擴(kuò)增,以

3、及細(xì)胞凍存、復(fù)蘇。相差倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化,并繪制第1、3、6代h-MSCs的生長(zhǎng)曲線。取傳至第3代的h-MSCs,分為4組進(jìn)行誘導(dǎo)分化:實(shí)驗(yàn)組、單純預(yù)誘導(dǎo)組、單純誘導(dǎo)組和空白對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組以bFGF預(yù)誘導(dǎo)24h后,再以5ng/mL、10ng/mL和20ng/mL濃度梯度的CNTF誘導(dǎo)12h;單純預(yù)誘導(dǎo)組僅行bFGF預(yù)誘導(dǎo)而無(wú)CNTF誘導(dǎo);單純誘導(dǎo)組不經(jīng)bFGF預(yù)誘導(dǎo)僅行CNTF誘導(dǎo),誘導(dǎo)液中的CNTF亦分為3個(gè)濃度梯度(5n

4、g/mL、10ng/mL和20ng/mL);空白對(duì)照組為無(wú)處理組,既無(wú)bFGF預(yù)誘導(dǎo)亦無(wú)CNTF誘導(dǎo)。應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)對(duì)培養(yǎng)的h-MSCs進(jìn)行CD34、CD44和CD54鑒定及對(duì)誘導(dǎo)分化后的細(xì)胞進(jìn)行NSE和Nestin鑒定。
　　結(jié)果：
　　1.h-MSCs在體外培養(yǎng)條件下,呈長(zhǎng)梭形,類似成纖維細(xì)胞,可穩(wěn)定增值傳代并可凍存復(fù)蘇,復(fù)蘇后細(xì)胞生長(zhǎng)特性與凍存前的細(xì)胞相似;
　　2.第1、3、6代h-MSCs生長(zhǎng)曲線呈“S

5、”形。第1代與第3代的細(xì)胞濃度比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.704),第1代與第6代比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.132),第3代與第6代比較差異亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.256);
　　3.應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)檢測(cè)培養(yǎng)的h-MSCs,顯示 CD44,CD54均呈陽(yáng)性表達(dá),CD34表達(dá)呈陰性;
　　4.h-MSCs在bFGF預(yù)誘導(dǎo)24h后,細(xì)胞形態(tài)基本無(wú)改變。CNTF誘導(dǎo)5h后部分細(xì)胞體積變小,以細(xì)胞核為中心收縮,逐漸呈錐形,

6、形成突起。CNTF誘導(dǎo)12h后,實(shí)驗(yàn)組中10ng/mLCNTF組和20ng/mLCNTF組細(xì)胞形態(tài)改變明顯,有2個(gè)或多個(gè)細(xì)長(zhǎng)突起,類似神經(jīng)元;5ng/mLCNTF亞組僅有少部分細(xì)胞形態(tài)稍發(fā)生變化?？瞻讓?duì)照組、單純預(yù)誘導(dǎo)組和單純誘導(dǎo)組的細(xì)胞形態(tài)基本無(wú)改變,仍為寬大扁平的梭形。
　　5.免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)顯示誘導(dǎo)后的細(xì)胞神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuron specific enolase,NSE)和巢蛋白(Nestin)均呈陽(yáng)性表達(dá)。各

7、組陽(yáng)性細(xì)胞率間比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=98.822,F=105.395,均P<0.01);實(shí)驗(yàn)組與空白對(duì)照組、單純預(yù)誘導(dǎo)組及單純誘導(dǎo)組比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均 P<0.01),但后三組之間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均 P>0.01);實(shí)驗(yàn)組內(nèi)兩兩之間比較顯示,20ng/mL組與10ng/mL組陽(yáng)性細(xì)胞率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.413,P=0.496),但均高于5ng/mL組(均 P<0.01)。10ng/mLCNTF實(shí)驗(yàn)組 NS

8、E陽(yáng)性細(xì)胞率(46.38±4.99)％,Nestin陽(yáng)性細(xì)胞率(45.76±4.46)%,為最多。
　　結(jié)論：
　　1.梯度離心法和全骨髓貼壁法相結(jié)合的方法,是一個(gè)較簡(jiǎn)便有效的體外 h-MSCs培養(yǎng)、純化體系;
　　2.h-MSCs可在體外培養(yǎng)擴(kuò)增,并可凍存、復(fù)蘇,復(fù)蘇后的細(xì)胞生長(zhǎng)特性與凍存前的細(xì)胞相似;
　　3.在本實(shí)驗(yàn)條件下,CNTF可誘導(dǎo) h-MSCs定向分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞;且10ng/mLCNTF可能為較