神經(jīng)元樣細胞對體外培養(yǎng)成肌干細胞功能活性的影響.pdf

1、骨骼肌組織工程的建立為各種骨骼肌疾病(肌營養(yǎng)不良、脊髓性肌萎縮等)提供了治療希望，也使整形外科治療創(chuàng)傷、腫瘤切除、失神經(jīng)支配所致的肌組織缺失進行外科重建成為可能[1,2]，許多學(xué)者致力于骨骼肌的體外構(gòu)建和替代研究，試圖創(chuàng)建功能化的肌組織。經(jīng)過多年的探索和努力，一些權(quán)威的研究組取得了相當(dāng)?shù)某煽?，不斷推進骨骼肌組織工程的研究進展:Powell[3,4]等采用膠原和基質(zhì)成功構(gòu)建三維骨骼肌組織，并對構(gòu)建組織施加機械刺激，確保體外培養(yǎng)肌組織的形成

2、、分化和收縮功能形成;Dennis和Kosnik[5,6]則探索出三維骨骼肌組織的自組裝模式，作者稱其構(gòu)建肌組織為Myooids，在橫向電刺激時具有持續(xù)的興奮性和收縮功能。德國的Bach研究組進行了成肌細胞與纖維蛋白三維支架的復(fù)合培養(yǎng)，獲得了具有極性分化功能的多核肌管[7,8]。然而，體外條件下進行骨骼肌組織的構(gòu)建仍面對諸多挑戰(zhàn)，尤其在神經(jīng)化方面。在體研究肌肉的神經(jīng)支配十分困難，目前研究人員一般采用將成肌細胞與神經(jīng)元細胞體外共培養(yǎng)來研究

3、成肌細胞與神經(jīng)細胞的相互作用，并取得了一系列進展。比較經(jīng)典的是從動物胚胎的脊髓獲取神經(jīng)元細胞進行純化，然后共培養(yǎng)。Wagner[9]共培養(yǎng)小鼠成肌細胞和胚胎大鼠脊髓，發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)組的分化肌管表達更高密度的乙酰膽堿受體(acetylcholinereceptor，AchRs)，肌管具有更強的導(dǎo)電能力。Das[10]等將大鼠的神經(jīng)細胞和肌細胞直接聯(lián)合培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)兩者之間形成了神經(jīng)肌肉接頭。神經(jīng)末梢及各種神經(jīng)遞質(zhì)的缺乏不利于分化肌管的長期存活和收

4、縮功能的維持，在體外條件下成肌細胞與外周神經(jīng)元的相關(guān)性是構(gòu)建神經(jīng)化骨骼肌組織的關(guān)鍵因素。上述研究明確了神經(jīng)元細胞對成肌干細胞的生物學(xué)影響，但由于原代分離培養(yǎng)的神經(jīng)元細胞對體外生存環(huán)境要求較高，體外成肌細胞的存活、增殖及分化環(huán)境很難同時滿足原代分離神經(jīng)元的生長要求，為體外骨骼肌組織工程構(gòu)建的開展帶來一定困難。
　　 PC12細胞是褐家鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞系起源于神經(jīng)嵴，易獲得，便于體外培養(yǎng)，細胞增殖能力強，表達神經(jīng)生長因子(ne

5、rvegrowthfactor,NGF)受體TrkA和p75NTR，因此NGF能與其受體結(jié)合使ras/raf/MEK/ERK信號通路活化[11-13]，使其停止增殖，細胞表型發(fā)生明顯改變，獲得神經(jīng)元特性，如長出細胞突起、形成突觸樣結(jié)構(gòu)、具有電興奮特性等。PC12細胞未分化時合成兒茶酚胺，在NGF的作用下可以合成乙酰膽堿并且長出神經(jīng)突結(jié)構(gòu)[14]。廣泛應(yīng)用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病的體外研究。周濤[15]等的研究表明，PC12細胞能與原代神經(jīng)元之間形

6、成突觸連接，JEON[16]等發(fā)現(xiàn)NGF誘導(dǎo)分化的PC12細胞之間可以形成突觸樣結(jié)構(gòu)。王靜[17]等將誘導(dǎo)分化的PC12細胞與心肌細胞共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)PC12細胞可作為體外再造心肌神經(jīng)支配研究模型的供體細胞。Glass[18]等的研究發(fā)現(xiàn)骨骼肌纖維與PC12細胞共培養(yǎng)時，肌肉細胞中的慢肌球蛋白輕鏈2的合成水平增高。Defez[19]等也證實了PC12細胞可以影響骨骼肌的分化進程。有關(guān)PC12細胞與C2C12細胞的體外共培養(yǎng)及相互的功能影響，

7、目前尚未發(fā)現(xiàn)相關(guān)的文獻報道。
　　 鑒于上述研究背景，本研究嘗試將已經(jīng)分化的PC12細胞與成肌細胞進行共培養(yǎng)，觀察其對成肌細胞是否具有支配關(guān)系，為構(gòu)建組織工程骨骼肌提供一種新的方法和思路。
　　 我們的主要研究內(nèi)容
　　 第一章，PC12細胞的分化培養(yǎng)及鑒定
　　 [目的]
　　 用NGF對PC12細胞的誘導(dǎo)分化，通過免疫熒光染色觀察NGF對PC12細胞的誘導(dǎo)分化作用。
　　 [方法]

8、r>　　 PC12細胞常規(guī)復(fù)蘇后用含100U/mL的青霉素、100μg/mL的鏈霉素和10％胎牛血清的DMEM/F12完全培養(yǎng)基，種植于培養(yǎng)瓶內(nèi)，37℃5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)將培養(yǎng)生長狀態(tài)良好的PC12細胞按2×104/mL密度接種于預(yù)先置有小蓋玻片的6孔板中，待細胞達到80-90％后，加入濃度為50ug/LNGF的DMEM/F12培養(yǎng)基對PC12細胞進行誘導(dǎo)分化培養(yǎng)，1d換液，相差顯微鏡下觀察PC12細胞形態(tài)。分別在分化3d和7d后

9、進行免疫熒光檢測。
　　 [結(jié)果]
　　 未分化的PC12細胞呈圓形、短梭形或三角形，有的細胞兩端有突起伸出，有的較長，其上還有小的突起，類似神經(jīng)元軸突。換含有NGF的培養(yǎng)液后，細胞伸出多條樹突狀突起，長短不一，突起數(shù)目不等。神經(jīng)元突起細長，大體形態(tài)與成熟神經(jīng)元相似。培養(yǎng)72h后，細胞之間相互連接交織成網(wǎng)狀。繼續(xù)培養(yǎng)至第7d，細胞進一步分化。
　　 [結(jié)論]
　　 細胞之間相互連接交織成網(wǎng)狀，說明NGF具

10、有促進PC12細胞分化的作用，神經(jīng)元細胞微管相關(guān)蛋白-2(mierotubuleassociatedprotein-2，MAP-2)是神經(jīng)元的特異性標(biāo)志物，主要存在于神經(jīng)元的胞體和樹突中，可作為神經(jīng)元的標(biāo)志蛋白PC12細胞免疫熒光MAP-2陽性表達表明在NGF的誘導(dǎo)下，PC12細胞已經(jīng)分化為較成熟的神經(jīng)元細胞。
　　 第二章，PC12細胞對成肌干細胞增殖的影響
　　 [目的]
　　 建立PC12細胞和C2C12細

11、胞Transwell共培養(yǎng)體系，通過流式細胞術(shù)檢測C2C12細胞周期，研究PC12細胞是否干擾C2C12細胞的體外增殖。
　　 [方法]
　　 細胞培養(yǎng)分組:(1)空白對照組:C2C12細胞單獨培養(yǎng);(2)實驗組:C2C12細胞與已分化的PC12細胞共培養(yǎng);(3)陰性對照組:C2C12細胞與未分化的PC12細胞共培養(yǎng);以上共培養(yǎng)組均為Transwell小室內(nèi)接種PC12細胞，六孔板內(nèi)接種C2C12細胞，細胞濃度為(1.0

12、～1.2)×108/L的C2C12細胞懸液，待細胞貼壁后，將已接種PC12的Transwell小室(孔徑為0.4μm)放入六孔板進行共培養(yǎng)，二者接種細胞的比例為1:1,24h后按不同的分組情況更換培養(yǎng)液，實驗組加入濃度為50ug/LNGF的DMEM/F12培養(yǎng)基對PC12細胞進行分化培養(yǎng)，空白對照組培養(yǎng)基同實驗組，陰性對照組換原有培養(yǎng)基，常規(guī)CO2培養(yǎng)箱孵育。另外將C2C12細胞接種到處理好的玻片上，分組及換液同上所述。共培養(yǎng)48h后收

13、集細胞進行流式檢測。同時對玻片上的細胞進行免疫熒光蛋白檢測。流式結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示，組間比較采用單因素方差分析(One-wayANOVA)，若差異有統(tǒng)計學(xué)意義，則采用LSD檢驗進行兩兩比較，P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 [結(jié)果]
　　 3組細胞增殖培養(yǎng)48h后，通過流式細胞術(shù)(flowcytometry，F(xiàn)CM)檢測儀檢測每組3個樣本細胞的分裂增殖周期，經(jīng)統(tǒng)計分析顯示不同組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

14、F＝103.00，P＜0.05)，LSD檢驗兩兩比較顯示實驗組與其他兩組之間DNA合成前期細胞所占百分比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，反應(yīng)增殖活力的增殖指數(shù)PrI(包括DNA合成期、DNA合成后期和有絲分裂期)差異也有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。同時MyoD蛋白免疫熒光檢測的陽性表達表明C2C12處于增殖時期，進一步說明已分化的PC12細胞抑制C2C12細胞的增殖。
　　 [結(jié)論]
　　 流式細胞術(shù)檢測證實已分化的P

15、C12細胞抑制C2C12細胞的增殖，為進一步構(gòu)建神經(jīng)化肌組織提供的一個新思路。
　　 第三章，PC12細胞對成肌干細胞分化的影響
　　 [目的]
　　 建立PC12細胞和C2C12細胞Transwell共培養(yǎng)系統(tǒng)，通過RT-PCR、qPCR及免疫熒光檢測C2C12細胞Myogenin、Desmin基因及蛋白的表達，分析PC12細胞細胞能否對C2C12細胞分化產(chǎn)生影響。
　　 [方法]
　　 細胞培

16、養(yǎng)分組:(1)空白對照組:C2C12細胞單獨培養(yǎng);(2)實驗組:C2C12細胞與已分化的PC12細胞共培養(yǎng);(3)陰性對照組:C2C12細胞與未分化的PC12細胞共培養(yǎng);以上共培養(yǎng)組均為Transwell小室內(nèi)接種PC12細胞，六孔板內(nèi)接種C2C12細胞，細胞濃度為(1.0～1.2)×108/L的C2C12細胞懸液，待細胞貼壁后，將已接種PC12的Transwell小室(孔徑為0.4μm)放入六孔板進行共培養(yǎng)，二者接種細胞的比例為1:1

17、,24h后按不同的分組情況更換培養(yǎng)液，實驗組加入濃度為50ug/LNGF的DMEM/F12培養(yǎng)基對PC12細胞進行分化培養(yǎng)，空白對照組培養(yǎng)基同實驗組，陰性對照組換原有培養(yǎng)基，常規(guī)CO2培養(yǎng)箱孵育。分別于第3、7d收集3組C2C12細胞，用Trizol法提取細胞總RNA，用Oligo(dT)逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，經(jīng)特定引物PCR擴增。免疫熒光檢測共培養(yǎng)7dMyogenin、Desmin特異蛋白的表達。結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示，組

18、間比較采用單因素方差分析(One-wayANOVA)，若差異有統(tǒng)計學(xué)意義，則采用LSD檢驗進行兩兩比較，P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 [結(jié)果]
　　 采用RT-PCR和qPCR對培養(yǎng)3、7d后所獲取的C2C12進行檢測，可見實驗組Myogenin、Desmin基因的表達均高于同一培養(yǎng)時間其他培養(yǎng)組，3d和7d時采用單因素方差分析顯示不同組Myogenin基因的表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=185.153，P＜0.

19、05和F=6020.343，P＜0.05)，不同組Desmin基因的表達差異也有統(tǒng)計學(xué)意義(F=2149.081，P＜0.05和F=57.612，P＜0.05)，Myogenin、Desmin特異性蛋白檢測顯示，實驗組熒光蛋白的表達更密集。表明已分化的PC12細胞促進C2C12細胞的分化。
　　 [結(jié)論]
　　 RT-PCR、qPCR及免疫熒光結(jié)果表明實驗組成肌分化基因Myogenin、Desmin的表達均明顯高于其他培